Summary

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) voor de studie van dendritische stekels

Published: October 02, 2021
doi:

Summary

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) wordt toegepast op beeld en analyseren van dendritische stekels in de muriene hippocampus.

Abstract

Driedimensionale elektronenmicroscopie (3D EM) geeft de mogelijkheid om morfologische parameters van dendritische stekels met nanoschaalresolutie te analyseren. Bovendien kunnen sommige kenmerken van dendritische stekels, zoals volume van de wervelkolom en post-synaptische dichtheid (PSD) (die post-synaptisch deel van de synaps vertegenwoordigt), aanwezigheid van presynaptische terminal, en glad endoplasmatisch reticulum of atypische vorm van PSD (bijv. multi-innervated stekels), alleen worden waargenomen met 3D EM. Door gebruik te maken van seriële block-face scanning elektronenmicroscopie (SBEM) is het mogelijk om 3D EM-gegevens gemakkelijker en reproduceerbaarder te verkrijgen dan bij het uitvoeren van traditionele seriële doorsneden. Hier laten we zien hoe we hippocampale monsters van muizen kunnen voorbereiden voor SBEM-analyse en hoe dit protocol kan worden gecombineerd met immunofluorescentiestudie van dendritische stekels. Milde fixatieperfusie stelt ons in staat om immunofluorescentiestudies uit te voeren met lichte microscopie op de ene helft van de hersenen, terwijl de andere helft was voorbereid op SBEM. Deze aanpak vermindert het aantal dieren dat voor het onderzoek moet worden gebruikt.

Introduction

De meeste excitatory synapsen in het centrale zenuwstelsel bevinden zich op dendritische stekels – kleine uitsteeksels van een neuronaal membraan. Deze uitsteeksels vormen beperkte biochemische compartimenten die de intracellulaire signaaltransductie regelen. Structurele plasticiteit van dendritische stekels en synapsen hangt nauw samen met de functionele veranderingen in synaptische werkzaamheid die ten grondslag liggen aan belangrijke processen zoals leren en geheugen1,2. Het is belangrijk op te merken dat elektronenmicroscopie (EM) de enige techniek is die het mogelijk maakt om te bepalen of een dendritische wervelkolom een presynaptische input heeft. EM-resolutie is ook nodig om ultrastructurele details te bestuderen, zoals de vorm van een postsynaptische dichtheid (PSD), die een postsynaptisch deel van een synaps vertegenwoordigt, of afmetingen van een dendritische wervelkolom, evenals de grootte en vorm van een axonale bouton. Bovendien is het met EM mogelijk om synapsen en hun omgeving te visualiseren.

Dankzij de vooruitgang in beeldvormings- en computertechnologieën is het mogelijk om hele neurale circuits te reconstrueren. Volume-elektronenmicroscopietechnieken, zoals seriële sectietransmissie-elektronenmicroscopie (ssTEM), seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie (SBEM) en gerichte ionenbundel scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) worden vaak gebruikt voor neuronale circuitreconstructies3.

In onze studies wordt de SBEM-methode met succes gebruikt om de structurele plasticiteit van dendritische stekels en PSD’s te onderzoeken in monsters van de muis hippocampus en organotypische hersenschijfjes 4,5. De SBEM is gebaseerd op de installatie van een miniatuur ultramicrotome in de scanning elektronenmicroscoopkamer6,7,8,9. De bovenkant van het monsterblok wordt afgebeeld en vervolgens wordt het monster op een opgegeven diepte door de ultramicrotome gesneden, waardoor een nieuw blokvlak wordt onthuld, dat opnieuw wordt afgebeeld en vervolgens wordt het proces herhaald8. Als gevolg hiervan blijft alleen het beeld van een blokvlak over, terwijl het gesneden plakje verloren gaat als puin. Daarom wordt SBEM een destructieve techniek genoemd, wat betekent dat het niet mogelijk is om dezelfde plaats opnieuw in beeld te brengen. Het voordeel van de destructieve on-block-methoden is echter dat ze geen last hebben van warpingproblemen en sectieverlies die de gegevenskwaliteit en de gegevensanalyse aanzienlijk kunnen beïnvloeden3. Bovendien biedt SBEM de mogelijkheid om een relatief groot gezichtsveld (> 0,5 mm × 0,5 mm) in hoge resolutie 3 in beeld tebrengen.

Om SBEM te gebruiken, moeten monsters worden voorbereid volgens een speciaal, zeer contrasterend protocol vanwege de backscattered elektronendetector die wordt gebruikt voor het verkrijgen van afbeeldingen. We laten hier zien hoe u monstervoorbereiding uitvoert volgens het protocol op basis van een procedure ontwikkeld door Deerinck10 (National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR) methode), met behulp van verminderde osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) vlekken ontwikkeld in de jaren 19808,11. Daarnaast introduceren we een fixatiebenadering in twee stappen, met milde fixatieperfusie die het mogelijk maakt om dezelfde hersenen te gebruiken, zowel voor immunofluorescentiestudies met lichte microscopie als SBEM.

In het protocol wordt een muisbrein voornamelijk gefixeerd met een mild fixatief en vervolgens in tweeën gesneden, en de ene hemisfeer wordt gepostfixeerd en voorbereid op immunofluorescentie (IF), terwijl de andere voor EM-studies (Figuur 1).

Figure 1
Figuur 1. Schematische weergave van de workflow voor de dendritische stekels voorbereiding voor de analyse met SBEM. Muizen werden geofferd en doordrenkt met een mild primair fixatief. De hersenen werden in tweeën gesneden en de ene hemisfeer werd gepostfixeerd met immunofluorescentie (IF)-specifiek fixatief, cryoprotected, gesneden met behulp van een cryostaat en verwerkt voor IF-studies, terwijl de andere hemisfeer werd gepostfixeerd met EM-fixatief, gesneden met het vibratoom en voorbereid op EM-studies. Hersenschijfjes voor SBEM-studies waren contrast, plat ingebed in hars, waarna een CA1-gebied van de hippocampus aan de pin werd gemonteerd en afgebeeld met SBEM (figuur 1). Het deel van het protocol dat in een geel vak is gemarkeerd, is in de video opgenomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Protocol

Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Nencki Instituut en toestemming van de Local Ethical Committee. De studies zijn uitgevoerd overeenkomstig de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 24 november 1986 (86/609/EEG), animal protection act van Polen en goedgekeurd door de eerste plaatselijke ethische commissie in Warschau. Alle inspanningen werden gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden tot een minimum te beperken. LET OP: Alle h…

Representative Results

Met behulp van de hierboven beschreven methode met hoog contrast kunnen afbeeldingen met een goede resolutie van het hersenweefsel van de muis worden verkregen. Een groot gezichtsveld van de SBEM-techniek vergemakkelijkt een nauwkeurige selectie van de interesseregio. Het grote beeld van het CA1-gebied van de hippocampus werd genomen om de lengte van stratum radiatum (SR) te meten (figuur 2A) en om de beeldvorming precies in het midden in te stellen (figuur 2B</…

Discussion

Er zijn veel variaties van de primaire NCMIR-methode beschreven door Deerinck in 201010. De basisprincipes blijven hetzelfde, maar afhankelijk van het soort bestudeerd materiaal worden kleine veranderingen doorgevoerd. Eerder werd beschreven dat verschillende harsen kunnen worden gebruikt om monsters voor SBEM in te bedden en bijvoorbeeld in het geval van planten is Spurr’s de hars bij uitstek vanwege de lage viscositeit die een betere infiltratie door de celwanden mogelijk maakt

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SBEM-beeldvorming, lichte microscopiebeeldvorming en elektronenmicroscopiemonstervoorbereiding werden uitgevoerd met behulp van de apparatuur van laboratory of Imaging Tissue and Function, die dient als een imaging-kernfaciliteit van het Nencki Institute of Experimental Biology.

Voor de voorbereiding van figuur 1 werd de afbeelding van een muis (Souris_02) en een flacon van de https://smart.servier.com/ gebruikt.

Dit werk werd ondersteund door het National Science Centre (Polen) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) toegekend aan KR.

Materials

Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Sodium pentobarbital (Morbital) Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Fixatives:
Glutaraldehyde (GA) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA G5882 Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative
Hydrochloric acid (HCl) POCH, Gliwice, Poland 575283115 pure p.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 441244 prilled, 95%
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA P4417-50TAB tablets
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S5881 reagent grade, Equation98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S3264
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S3139
Perfusion:
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 14519-14
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10091-12
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany KD-FINE 900413 1.80 x 40 mm
Pair of fine (Graefe) tweezers Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11050-10
Perfusion pump Lead Fluid BQ80S
Plastic vials Profilab, Warsaw, Poland 534.02 plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm
Straight iris scissors (~9 cm) Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 14058-11
Brain slices preparation for EM:
12-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 712001
Cyanoacrylic glue Fenedur, Montevideo, Uruguay
Glass vials Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72632 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100
Pasteur pipette VWR, Radnor, PA, USA 612-4545 LDPE, disposable, 7.5 ml
Razor blade Wilkinson Sword, London, UK Classic double edge safety razor blades
Scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK No. 20
Vibratome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica VT1000 S
Brain slices preparation for IF:
96-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 701101
Criostat Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica CM 1950
Ethylene glycol Bioshop, Burlington, Canada ETH001
Low-profile disposable blade 819 Leica Biosystems Inc., USA 14035838925
Scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK No. 20
Sodium azide (NaN3) POCH, Gliwice, Poland 792770426
Sucrose POCH, Gliwice, Poland 772090110
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound Leica Biosystems, Switzerland 14020108926
Immunostaining:
24-well plate NEST, Rahway, NJ, USA 702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody Merck-Millipore, Burlington, MA, USA MAB1598
Confocal microscope Zeiss, Göttingen, Germany Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm)
Cover slide Menzel Glaser, Braunschweig, Germany B-1231 24 x 60 mm
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA A31570
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 00-4959-52
Microscope slide Thermo Scientific, Waltham, MA, USA AGAA00008 SuperFrost
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA 017-000-121
Shaker JWElectronic, Warsaw, Poland KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade Bioshop, Burlington, Canada TRX506
Electron microsocpy sample preparation
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate POCH, Gliwice, Poland 746980113
Aclar 33C Film Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 50425 Fluoropolymer Film embedding sheet
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA T58203 Epoxy embedding medium accelerator
Durcupan ACM single component A, M Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44611 Durcupan ACM single component A, M epoxy resin
Durcupan ACM single component B Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44612 Durcupan ACM single component B, hardener 964
Durcupan ACM single component D Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 44614 Durcupan ACM single component D , plasticizer
Ethyl alcohol absolute POCH, Gliwice, Poland 64-17-5 Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC
Genlab laboratory oven Wolflabs, York, UK Mino/18/SS Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply
L-Aspartic acid Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA A-9256 reagent grade, Equation98% (HPLC)
Lead (II) nitrate Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 467790 Equation99.95% trace metals basis
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 75632 for electron microscopy, 4% in H2O
pH meter Elmetron, Zabrze, Poland CP-5-5
Rotator BioSan, Józefów, Poland Multi Bio RS-24 rotator Multi Bio RS-24
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA S5881 reagent grade, Equation98%, pellets (anhydrous)
Sunflower mini shaker Grant bio, Shepreth,UK PD-3D
Syringe filter Millipore, Burlington, MA, USA SLGP033NB 0,22 µm pore size
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA 88535 purum p.a., for electron microscopy, Equation99.0% (N)
Uranyl acetate Serva, Heidelberg, Germany 77870 Uranyl acetate·2H2O, research grade
Water bath WSL, Swietochlowice, Poland LWT
Specimen mounting for SBEM
96-well culture plate VWR, Radnor, PA, USA 734-2782 96-well plates, round bottom, non treated
AM Gatan 3View stub handling tweezers Micro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands
50-001521
Binocular OPTA-TECH, Warsaw, Poland X2000
Conductive glue Chemtronics, Georgia, USA CW2400 conductive eopxy
Gatan 3View sample pin stubs Micro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands
10-006003
Parafilm Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA P7793 roll size 20 in. × 50 ft
Pelco conductive silver paint Ted Pella, Redding, CA, USA 16062-15 PELCO® Conductive Silver Paint, 15g
Razor blades double edge Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72000 Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box.
Scanning Electron Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm
trim 90° diamond knife Diatome Ltd., Nidau, Switzerland DTB90
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica ultracutR
Software webpage tutorials
FijiJ https://fiji.sc/
Microscopy Image Browser http://mib.helsinki.fi/ http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstruct https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Animals
Mice Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.

References

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
  2. Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
  3. Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
  4. Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
  5. Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).
  6. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  7. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  8. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
  9. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
  11. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  12. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
  15. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  16. Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  19. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
  20. Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).
  21. Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
  22. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  23. Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
  24. Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  25. Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
  26. Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
  27. Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
  28. Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
  29. Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
  30. Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
  31. Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).
  32. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
  33. Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
  34. Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).

Play Video

Cite This Article
Śliwińska, M. A., Cały, A., Szymański, J., Radwańska, K. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines. J. Vis. Exp. (176), e62712, doi:10.3791/62712 (2021).

View Video