Detaljerte trinnvise protokoller er beskrevet her for å studere mekaniske signaler in vitro ved hjelp av multipotente O9-1 nevrale kamceller og polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet.
Neural crest celler (NCCs) er virveldyr embryonale multipotente celler som kan migrere og skille seg inn i et bredt utvalg av celletyper som gir opphav til ulike organer og vev. Vevsstivhet produserer mekanisk kraft, et fysisk signal som spiller en kritisk rolle i NCC-differensiering; Mekanismen er imidlertid fortsatt uklar. Metoden beskrevet her gir detaljert informasjon for optimalisert generering av polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet, nøyaktig måling av slik stivhet og evaluering av virkningen av mekaniske signaler i O9-1 celler, en NCC-linje som etterligner in vivo NCCs.
Hydrogelstivhet ble målt ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM) og indikerte forskjellige stivhetsnivåer tilsvarende. O9-1 NCC dyrket på hydrogeler av varierende stivhet viste forskjellig cellemorfologi og genuttrykk av stressfibre, noe som indikerte varierende biologiske effekter forårsaket av mekaniske signalendringer. Videre slo dette fast at varierende hydrogelstivhet resulterte i et effektivt in vitro-system for å manipulere mekanisk signalering ved å endre gelstivhet og analysere den molekylære og genetiske reguleringen i NCCs. O9-1 NCCs kan skille seg ut i et bredt spekter av celletyper under påvirkning av de tilsvarende differensieringsmediene, og det er praktisk å manipulere kjemiske signaler in vitro. Derfor er dette in vitro-systemet et kraftig verktøy for å studere rollen som mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med kjemiske signaler, noe som vil hjelpe forskere til å bedre forstå de molekylære og genetiske mekanismene for nevral kamutvikling og sykdommer.
Neural crest celler (NCCs) er en gruppe stamceller under virveldyr embryogenese med en bemerkelsesverdig evne til å migrere og bidra til utvikling av ulike organer og vev. NCCer kan skille seg ut i forskjellige celletyper, inkludert sensoriske nevroner, brusk, bein, melanocytter og glatte muskelceller, avhengig av plasseringen av aksial opprinnelse og den lokale miljøveiledningen til NCC1,2. Med evnen til å skille seg ut i et bredt spekter av celletyper, kan genetiske abnormiteter som forårsaker dysregulering på et hvilket som helst stadium av nevral kam (NC) utvikling føre til mange medfødte sykdommer2. For eksempel fører perturbasjoner under dannelsen, migrasjonen og utviklingen av NCCer til utviklingsforstyrrelser kjent samlet som nevrokritiske1,3. Disse sykdommene spenner fra kraniofaciale defekter på grunn av svikt i NCC-dannelse, som Treacher Collins syndrom, til utvikling av ulike kreftformer på grunn av NCC metastatisk migrasjonsevne, sett i melanom3,4,5,6. I løpet av de siste tiårene har forskere gjort bemerkelsesverdige funn om NCCs roller og mekanismer i utvikling og sykdommer, der de fleste funnene er fokusert på kjemiske signaler7,8. Mer nylig har mekaniske signaler blitt indikert for å spille en kritisk, men dårlig forstått rolle i NCC utvikling9,10.
Miljøsignalene til NCCer spiller en kritisk rolle under utviklingen, inkludert regulering av NCC-differensiering i ulike celletyper. Miljøsignaler, for eksempel fysiske signaler, påvirker pivotal atferd og cellulære responser, for eksempel funksjonell diversifisering. Mechanotransduction gjør det mulig for celler å føle og reagere på disse signalene for å opprettholde ulike biologiske prosesser2. NCCer er omgitt av nærliggende celler og forskjellige substrater, for eksempel den ekstracellulære matrisen (ECM), som kan gi opphav til mekaniske stimuli for å opprettholde homeostase og tilpasse seg endringene gjennom skjebnebestemmelse, spredning og apoptose11. Mekanotransduksjon begynner ved plasmamembranen der den sensoriske komponenten av mekaniske ekstracellulære stimuli oppstår, noe som resulterer i intracellulær regulering av celle12. Integrins, fokale vedheft og veikryss i plasmamembranreléet mekaniske signaler, for eksempel skjærekrefter, stress og stivheten til omkringliggende substrater, til kjemiske signaler for å produsere cellulære responser12. Videresending av kjemiske signaler fra plasmamembranen til den endelige cellulære reguleringen utføres via forskjellige signalveier for å fullføre vitale prosesser for organismen, for eksempel differensiering.
Flere studier har antydet at mekanisk signalering fra substratstivhet spiller en rolle i celledifferensiering13,14. For eksempel har tidligere studier vist at mesenchymale stamceller (MSC) vokst på myke substrater med en stivhet som ligner på hjernevev (i området 0,1-1,0 kPa) resulterte i nevronal celledifferensiering15,16. Imidlertid skiller flere MSCer seg inn i myokyttlignende celler når de vokser på 8-17 kPa-substrater som etterligner muskelens stivhet, mens osteoblastlignende differensiering ble observert når MSCer ble dyrket på stive substrater (25-40 kPa)15,16. Betydningen av mekanotransduksjon fremheves av uregelmessigheter og abnormiteter i den mekaniske signalveien som potensielt fører til alvorlige utviklingsfeil og sykdommer, inkludert kreft, kardiovaskulære sykdommer og osteoporose17,18,19. I kreft er normalt brystvev mykt, og risikoen for brystkreft øker i stivt og tett brystvev, et miljø som er mer lik brystsvulster15. Med denne kunnskapen kan effekten av mekanisk signalering på NCC-utvikling studeres gjennom enkel manipulering av substratstivhet gjennom et in vitro-system, noe som gir ytterligere fordeler og muligheter til å forstå det grunnleggende om NC-relatert sykdomsprogresjon og etiologi.
For å studere effekten av mekaniske signaler i NCCer etablerte vi et effektivt in vitro-system for NCCer basert på optimalisering av tidligere publiserte metoder og evaluering av NCCs respons på ulike mekaniske signaler20,21. Det ble gitt en detaljert protokoll for varierende hydrogelstivhetsforberedelse og evaluering av virkningen av mekanisk signalering i NCCer. For å oppnå dette benyttes O9-1 NCC som NC-modell for å studere effekter og endringer som følge av stive kontra myke hydrogeler. O9-1 NCCs er en stabil NC celle linje isolert fra musen embryo (E) på dag 8.5. O9-1 NCCer etterligner NCCer in vivo fordi de kan skille seg ut i ulike NC-avledede celletyper i definert differensieringsmedie22. For å studere mekanisk signalering av NCCer ble et matrisesubstrat fremstilt med justerbar elastisitet fra varierende konsentrasjoner av akrylamid- og bisakrylamidløsninger for å oppnå ønsket stivhet, korrelert med den biologiske substratstivheten20,21,23. For å optimalisere betingelsene for matriseunderlag for NCCer, spesielt O9-1-celler, ble det gjort endringer fra den tidligere publiserte protokollen20. En endring i denne protokollen var å inkubere hydrogeler i kollagen I, fortynnet i 0,2% eddiksyre i stedet for 50 mM HEPES, ved 37 °C over natten. Den lave pH av eddiksyre fører til en homogen fordeling og høyere kollagen I inkorporering, og dermed muliggjør en mer jevn vedlegg av ECM protein24. I tillegg ble en kombinasjon av hesteserum og fostal bovin serum (FBS) brukt i konsentrasjonene på henholdsvis 10% og 5% i fosfatbuffersalt (PBS), før de lagret hydrogelene i inkubatoren. Hesteserum ble brukt som et ekstra supplement til FBS på grunn av sin evne til å fremme celleproliferasjon og differensiering ved konsentrasjonen på 10%25.
Med denne metoden ble et biologisk miljø etterlignet av ECM-proteinbelegget (f.eks. kollagen I) for å skape et nøyaktig in vitro-miljø for NCCer å vokse og overleve20,21. Stivheten til de forberedte hydrogelene ble kvantitativt analysert via atomkraftmikroskopi (AFM), en kjent teknikk for å skildre den elastiske modulus26. For å studere effekten av ulike stivhetsnivåer på NCCer ble ville O9-1-celler dyrket og forberedt på hydrogeler for immunfluorescens (IF) farging mot filamentøs aktin (F-aktin) for å vise forskjellene i celleadhesjon og morfologier som svar på endringer i substratstivhet. Ved hjelp av dette in vitro-systemet vil forskerne kunne studere rollene til mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med andre kjemiske signaler for å få en dypere forståelse av forholdet mellom NCCer og mekanisk signalering.
Målet med den nåværende studien er å gi et effektivt in vitro-system for bedre å forstå effekten av mekaniske signaler i NCC. I tillegg til å følge den trinnvise protokollen nevnt ovenfor, må forskerne huske på at cellekulturen til O9-1 NCCs påvirkes av typen glassdeksler som brukes til å forberede hydrogeler. For eksempel ble det bemerket at celler frøet på en bestemt type glassdekslerlip (se materialtabellen) overlevde og spredte seg godt, mens dyrkede celler frøet på andre typ…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Ana-Maria Zaske, operatør for Atomic Force Microscope-UT Core-anlegget ved University of Texas Health Sciences Center, for den medvirkende ekspertisen i AFM i dette prosjektet. Vi takker også finansieringskildene fra National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 og R01HL142704 til J. Wang).
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |