神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

神経堤細胞(NCC)は、脊椎動物胚発生時の幹細胞群であり、様々な臓器や組織の発達に寄与する著しい能力を有する。NCCは、NCC1,2の軸方向起点の位置や局所的環境誘導に応じて、感覚ニューロン、軟骨、骨、メラノサイト、平滑筋細胞を含む異なる細胞タイプに分化することができる。広範囲の細胞型に分化する能力を持つ、神経堤(NC)の発達の任意の段階で調節不全を引き起こす遺伝的異常は、多数の先天性疾患に至る^{可能性がある2。}例えば、NCCの形成、移動、および発達中の摂動は、神経経皮症^1,3として総称して知られる発達障害につながる。これらの疾患は、NCC形成における障害による頭蓋顔面欠損(トレチャー・コリンズ症候群など)から、黒色腫^{3、4、5、6}に見られるようにNCC転移性回遊能力に起因する様々な癌の発症まで多岐にわたる。過去数十年にわたり、研究者は開発および疾患におけるNCCの役割とメカニズムについて顕著な発見を行い、その大半は化学信号^7,8に焦点を当てています。最近では、機械的信号は、NCC開発^9、10において重要だが十分に理解されていない役割を果たしていることが示されている。

NCCの環境的な手掛かりは、NCC分化を様々な細胞タイプに規制するなど、開発中に重要な役割を果たします。環境の手掛かり、例えば、物理的な手がかりは、機能多様化などの極めて重要な行動および細胞応答に影響を与える。メカノトランスダクションは、細胞が様々な生物学的プロセスを維持するためにそれらの手がかりを感知し、応答することを可能に^する2.NCCは、隣接する細胞および細胞外マトリックス(ECM)のような異なる基質に囲まれており、恒常性を維持し、運命決定、増殖、およびアポトーシス¹¹を通じて変化に適応するために機械的刺激を生じさせることができる。メカノトランスダクションは、機械的細胞外刺激の感覚成分が生じる形質膜から始まり、細胞¹²の細胞内調節をもたらす。インテグリン、焦点接着、および、剪断力、応力、および周囲の基質の剛性などの機械的信号を、細胞応答¹²を生成する化学信号に、プラズマ膜リレーの接合部。細胞膜から最終的な細胞調節への化学信号の中継は、分化などの生物の重要なプロセスを確定するために異なるシグナル伝達経路を介して行われます。

いくつかの研究は、基質剛性からの機械的シグナル伝達が細胞分化^13、14に役割を果たしていることを示唆している。例えば、これまでの研究では、脳組織と同様の硬直性を有する軟質基質上で成長した間葉系幹細胞(MCC)(0.1〜1.0kPa)が神経細胞分化^15,16を生じることが示されている。しかし、筋肉の剛性を模倣した8-17 kPa基質上で増殖するとより多くのMSCが筋細胞様細胞に分化し、一方、MSCを硬質基質上で培養した際に骨芽細胞様分化が観察された^{(25-40kPa)15,16。}メカノトランスダクションの意義は、癌、心血管疾患、骨粗鬆症^17、18、19を含む重篤な発達上の欠陥および疾患につながる可能性のある機械的シグナル伝達経路の不規則性および異常によって強調される。癌では、正常な乳房組織は軟らかく、乳房癌のリスクは、硬く、密な乳房組織、乳房腫瘍¹⁵に似た環境において増加する。この知見により、生体信号がNCC開発に及ぼす影響を、in vitroシステムを通じて基質剛性を簡単に操作することで研究することができ、NC関連疾患の進行と病因の基礎を理解する上でさらなる利点と可能性を提供します。

NCCにおける機械的信号の影響を調べ、従来公表された方法の最適化と異なる機械的信号^20,21に対するNCCの応答評価に基づくNCCの効率的なインビトロシステムを確立した。ヒドロゲルの剛性の調製とNCCにおける機械的シグナリングの影響の評価を行うための詳細なプロトコルが提供されました。これを達成するために、O9-1 NCCは、硬い対ソフトヒドロゲルに応答して効果と変化を研究するためにNCモデルとして利用されています。O9-1 NCCは、8.5日目にマウス胚(E)から分離された安定したNC細胞株です。O9-1 NCC は、定義された分化メディア²²の各種 NC 由来細胞タイプに分化できるため、インビボで NCC を模倣しています。NCCの機械的シグナル伝達を研究するために、マトリックス基質を、所望の剛性を達成するために、所望の剛性を達成するために、アクリルアミドおよびビスアクリルアミド溶液の様々な濃度から調整可能な弾性で作製した、生物学的基質剛性^20、21、23と相関する。NCC用マトリックス基板の条件を最適化するために、具体的にはO9-1細胞は、以前に公開されたプロトコル²⁰から改変を行った。このプロトコルで行われた1つの変更は、コラーゲンIのヒドロゲルをインキュベートし、50mM HEPESの代わりに0.2%の酢酸に希釈し、一晩で37°Cで行った。酢酸の低pHは均質な分布と高いコラーゲンIの組み込みをもたらし、したがってECMタンパク質²⁴のより均一な付着を可能にする。また、ウシ胎児血清(FBS)との組み合わせは、インキュベーターにヒドロゲルを貯蔵する前に、それぞれリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で10%および5%の濃度で使用した。^10%25の濃度で細胞増殖および分化を促進する能力のために、FBSへの追加サプリメントとして馬血清を使用した。

この方法により、生物環境をECMタンパク質コーティング(例えば、コラーゲンI)によって模倣し、NCCが成長し^、20,21を生き残るための正確なインビトロ環境を作り出した。調製されたヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡(AFM)を介して定量的に分析した、弾性率²⁶を描写するよく知られた技術である。NCCに対する異なる剛性レベルの影響を研究するために、野生型O9-1細胞を培養し、フィラメントアクチン(F-アクチン)に対する免疫蛍光(IF)染色用のヒドロゲルに調製し、基質剛性の変化に応じて細胞接着および形態の違いを示した。このインビトロシステムを利用して、NCCにおける機械的シグナル伝達の役割と他の化学信号との相互作用を研究し、NCCと機械的シグナル伝達の関係を深く理解することができます。