Un sistema O9-1/Hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono un gruppo di cellule staminali durante l’embriogenesi dei vertebrati con una notevole capacità di migrare e contribuire allo sviluppo di vari organi e tessuti. Le NCC possono differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui neuroni sensoriali, cartilagine, ossa, melanociti e cellule muscolari lisce, a seconda della posizione di origine assiale e della guida ambientale locale dell’NCC^1,2. Con la capacità di differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule, le anomalie genetiche che causano la disregolazione in qualsiasi fase dello sviluppo della cresta neurale (NC) possono portare a numerose malattie congenite². Ad esempio, le perturbazioni durante la formazione, la migrazione e lo sviluppo di NCC portano a disturbi dello sviluppo noti collettivamente come neurocristopatie^1,3. Queste malattie vanno dai difetti craniofacciali dovuti al fallimento nella formazione di NCC, come la sindrome di Treacher Collins, allo sviluppo di vari tumori dovuti alla capacità migratoria metastatica dell’NCC, come si vede nel melanoma^3,4,5,6. Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno fatto notevoli scoperte sui ruoli e i meccanismi delle NCC nello sviluppo e nelle malattie, con la maggior parte dei risultati focalizzati sui segnali^{chimici 7,8}. Più recentemente, i segnali meccanici sono stati indicati per svolgere un ruolo critico ma poco compreso nello sviluppo NCC^9,10.

I segnali ambientali degli NCC svolgono un ruolo fondamentale durante il loro sviluppo, compresa la regolazione della differenziazione NCC in vari tipi di cellule. I segnali ambientali, ad esempio i segnali fisici, influenzano i comportamenti cardine e le risposte cellulari, come la diversificazione funzionale. La meccanotrasduzione consente alle cellule di percepire e rispondere a tali segnali per mantenere vari processi biologici². Gli NCC sono circondati da cellule vicine e diversi substrati, come la matrice extracellulare (ECM), che può dare origine a stimoli meccanici per mantenere l’omeostasi e adattarsi ai cambiamenti attraverso la determinazione del destino, la proliferazione e l’apoptosi¹¹. La meccanotrasduzione inizia alla membrana plasmatica dove si verifica la componente sensoriale degli stimoli meccanici extracellulari, con conseguente regolazione intracellulare della cellula¹². Integrine, aderenze focali e giunzioni della membrana plasmatica relè segnali meccanici, come forze di taglio, stress e rigidità dei substrati circostanti, in segnali chimici per produrre risposte cellulari¹². La trasmissione di segnali chimici dalla membrana plasmatica alla regolazione cellulare finale viene effettuata attraverso diverse vie di segnalazione per finalizzare i processi vitali per l’organismo, come la differenziazione.

Diversi studi hanno suggerito che la segnalazione meccanica dalla rigidità del substrato gioca un ruolo nella differenziazione cellulare^13,14. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) cresciute su substrati molli con una rigidità simile a quella del tessuto cerebrale (nell’intervallo di 0,1-1,0 kPa) hanno determinato la differenziazione delle cellule neuronali^15,16. Tuttavia, più MSC si differenziano in cellule simili ai miociti quando cresciute su substrati di 8-17 kPa che imitano la rigidità del muscolo, mentre la differenziazione simile agli osteoblasti è stata osservata quando le MSC sono state coltivate su substrati rigidi (25-40 kPa)^15,16. Il significato della meccanotrasduzione è evidenziato dalle irregolarità e dalle anomalie nella via di segnalazione meccanica che potenzialmente portano a gravi difetti e malattie dello sviluppo, tra cui cancro, malattie cardiovascolari e osteoporosi^17,18,19. Nei tumori, il tessuto mammario normale è morbido e il rischio di cancro al seno aumenta nel tessuto mammario rigido e denso, un ambiente che è più simile ai tumori al seno¹⁵. Con queste conoscenze, gli effetti della segnalazione meccanica sullo sviluppo di NCC possono essere studiati attraverso la semplice manipolazione della rigidità del substrato attraverso un sistema in vitro, fornendo ulteriori vantaggi e possibilità nella comprensione dei fondamenti della progressione della malattia correlata alla NC e dell’eziologia.

Per studiare l’impatto dei segnali meccanici negli NCC, abbiamo istituito un efficiente sistema in vitro per NCC basato sull’ottimizzazione di metodi precedentemente pubblicati e sulla valutazione delle risposte degli NCC a diversi segnali meccanici^20,21. È stato fornito un protocollo dettagliato per la preparazione della rigidità dell’idrogel variabile e la valutazione dell’impatto della segnalazione meccanica negli NCC. Per raggiungere questo obiettivo, gli NCC O9-1 vengono utilizzati come modello NC per studiare gli effetti e i cambiamenti in risposta agli idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi. Gli NCC O9-1 sono una linea cellulare NC stabile isolata dall’embrione di topo (E) al giorno 8.5. Gli NCC O9-1 imitano gli NCC in vivo perché possono differenziarsi in vari tipi di cellule derivate da NC in mezzi di differenziazione definiti²². Per studiare la segnalazione meccanica degli NCC, è stato fabbricato un substrato a matrice con elasticità sintonizzabile da concentrazioni variabili di soluzioni di acrilammide e bis-acrilammide per ottenere la rigidità desiderata, correlata alla rigidità del substrato biologico^20,21,23. Per ottimizzare le condizioni del substrato matriciale per NCC, in particolare le celle O9-1, sono state apportate modifiche dal protocollo²⁰precedentemente pubblicato. Una modifica apportata a questo protocollo è stata quella di incubare idrogel nel collagene I, diluito in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES, a 37 °C durante la notte. Il basso pH dell’acido acetico porta ad una distribuzione omogenea e ad una maggiore incorporazione di collagene I, consentendo così un attaccamento più uniforme della proteina ECM^24. Inoltre, una combinazione di siero equino e siero bovino fetale (FBS) è stata utilizzata alle concentrazioni del 10% e del 5% rispettivamente nella soluzione salina tampone fosfato (PBS), prima di conservare gli idrogel nell’incubatrice. Il siero di cavallo è stato utilizzato come supplemento aggiuntivo a FBS grazie alla sua capacità di promuovere la proliferazione e la differenziazione cellulare alla concentrazione del 10%²⁵.

Con questo metodo, un ambiente biologico è stato imitato dal rivestimento proteico ECM (ad esempio, Collagen I) per creare un ambiente in vitro accurato per far crescere e sopravvivere^20,21. La rigidità degli idrogel preparati è stata analizzata quantitativamente tramite microscopia a forza atomica (AFM), una tecnica ben nota per rappresentare il modulo elastico²⁶. Per studiare l’effetto di diversi livelli di rigidità sugli NCC, le cellule O9-1 wild-type sono state coltivate e preparate su idrogel per la colorazione di immunofluorescenza (IF) contro l’actina filamentosa (F-actina) per mostrare le differenze nell’adesione cellulare e nelle morfologie in risposta ai cambiamenti nella rigidità del substrato. Utilizzando questo sistema in vitro, i ricercatori saranno in grado di studiare i ruoli della segnalazione meccanica negli NCC e la sua interazione con altri segnali chimici per ottenere una comprensione più profonda della relazione tra NCC e segnalazione meccanica.