我々は、Cas9/シングルガイドRNA(sgRNA)リボヌクレオタンパク質複合体をウイルス様粒子内にロードするためのシンプルで安価なプロトコルを開発しました。「ナノブレード」と呼ばれるこれらの粒子は、不死化および初代細胞ならびにインビボでCas9/sgRNA複合体の効率的な送達を可能にする。
クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)-Casシステムは、真核細胞におけるゲノム編集を民主化し、数多くの革新的なアプリケーションの開発につながった。しかしながら、Cas9タンパク質およびシングルガイドRNA(sgRNA)の標的細胞への送達は、技術的に困難な場合がある。レンチウイルス(LV)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するものなどの古典的なウイルスベクターは、Cas9タンパク質およびその関連sgRNAをコードする導入遺伝子を多くの初代細胞およびインビボで効率的に送達することを可能にする。それにもかかわらず、これらのベクターは、標的細胞ゲノムにおける導入遺伝子の組み込み、限られた貨物容量、および標的細胞におけるCas9タンパク質およびガイドRNAの長期発現などの欠点に苦しむ可能性がある。
これらの問題のいくつかを克服するために、マウス白血病ウイルス(MLV)に基づく送達ベクターが開発され、コード導入遺伝子の非存在下でCas9タンパク質およびそれに関連するガイドRNAをパッケージ化した。MLV由来の構造タンパク質GagのC末端にCas9タンパク質を融合させることにより、Cas9タンパク質とsgRNA(ナノブレードと命名)をロードしたウイルス様粒子(VLP)が形成された。ナノブレードは、産生細胞の培養培地から収集し、精製、定量し、標的細胞を形質導入し、活性Cas9/sgRNA複合体を送達するために使用することができる。ナノブレードは、リボヌクレオタンパク質(RNP)の貨物を広範囲の初代および不死化細胞に一過性かつ迅速に送達し、修飾Cas9タンパク質を使用して、標的遺伝子の一過性転写活性化などの他の用途向けにプログラムすることができます。ナノブレードは、注射された成体マウスの肝臓および卵母細胞においてインビボゲノム編集が可能であり、トランスジェニック動物を生成することができる。最後に、ドナーDNAと複合化して、「トランスフェクションフリー」相同性指向修復を行うことができます。ナノブレード調製は、簡単で、比較的低コストであり、そして任意の細胞生物学実験室で容易に実施することができる。
他のプログラム可能なヌクレアーゼと比較して、CRISPR-Casシステムは、真核細胞における配列特異的ゲノムターゲティングおよび切断の手順を劇的に簡素化し、民主化しました。sgRNAの単純な発現により、ユーザーはほぼすべての細胞遺伝子座に対してCas9タンパク質(または最適化されたバリアント)をプログラムできます1。このシナリオでは、Cas9タンパク質およびsgRNAの送達が、部位特異的変異誘発を行う際の主な制限となる。不死化細胞では、sgRNAおよびCasタンパク質をトランスフェクトプラスミドから容易に発現させ、ほとんどの細胞で効率的なゲノム標的化を達成することができる。しかし、Cas9/sgRNA複合体の構成的発現は、Cas9タンパク質のオフターゲット活性を増加させ、非特異的遺伝子座2に望ましくない変化をもたらす可能性がある。初代細胞では、DNAトランスフェクションを達成することは技術的に困難であり、発現不良またはトランスフェクトされた細胞のわずかな割合につながる可能性がある。古典的なDNAトランスフェクションに代わるものは、Cas9およびsgRNAをコードする導入遺伝子を送達するウイルスベクターの使用、または合成sgRNAに結合された組換えCas9タンパク質のエレクトロポレーションを含む。しかしながら、これらのアプローチは、細胞宿主ゲノム内での導入遺伝子組込み(古典的なレトロウイルスおよびレンチウイルス発現ベクターの場合と同様)、細胞因子による制限、およびCas9タンパク質およびsgRNAの構成的発現をもたらし得る。
Cas9/sgRNP 複合体のエレクトロポレーションは、これらの問題のほとんどを克服し、初代細胞およびインビボでの効率的かつ一過性の送達をもたらし、用量依存性応答を可能にすることができる。それにもかかわらず、それは通常高価な装置と試薬に依存しており、多数の細胞を処理する必要がある場合、高級化することも困難です。上記の技術の代替として、これらの著者らは、他のウイルス由来のカプシドタンパク質送達系と概念的に類似したCas9タンパク質およびsgRNA3用のレトロウイルス送達ベクターである「ナノブレード」を開発しました4,5,6,7,8。ナノブレードは、レトロウイルス由来のGagポリタンパク質の自然な能力を利用して、培養細胞で単独で発現すると、細胞外培地中に放出されるVLPを産生します9。Cas9タンパク質をマウス白血病ウイルス(MLV)Gagポリタンパク質のC末端末端に融合させ、sgRNAおよびウイルスエンベロープ糖タンパク質を共発現させることにより、Cas9タンパク質を放出されたVLPまたはナノブレード内に包埋することができる。精製時に、ナノブレードを標的細胞と共にインキュベートするか、インビボで注射して、Cas9/sgRNA RNP複合体の迅速、一過性、および用量依存的な送達を媒介することができます3。
ナノブレードは、複数のsgRNAでプログラムして異なる遺伝子座で同時に編集したり、Cas9バリアントを使用して標的特異的転写活性化や抑制などの他のアプリケーションを実行することができます3。組換え発現に依存するタンパク質エレクトロポレーションとは対照的に、文献から新たに記載されたCas変異体は、Gag融合発現ベクターに容易にクローニングすることができ、汎用性の高いプラットフォームとなる。ナノブレードをさらに複合化または一本鎖および二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)と装填して、相同性指向性修復を行うことができます3。ナノブレードの生産は比較的簡単で安価です。さらに、ナノブレードは、4°Cで何日間も保管することも、-80°Cで長期保管することもできます。通常、ナノブレードは、ほとんどの不死化および初代培養細胞において、効率的で導入遺伝子を含まないゲノム編集を媒介します。しかし、一部の初代細胞はウイルス粒子の存在に敏感である可能性があり、その結果、死亡率が増加する。自然免疫系の細胞はまた、ナノブレードの存在に反応し(ウイルス起源のため)、活性化され得る。このような場合、形質導入プロトコルを最適化して、ナノブレードへの曝露時間を制限し、非特異的な影響を最小限に抑える必要があります。ナノブレードは、他の利用可能なCRISPR送達方法に代わる実行可能で実装が容易な代替手段です。
ナノブレードは、細胞株および初代細胞におけるCas9/sgRNA RNP複合体の迅速かつ用量依存的な送達を可能にする。従来のトランスフェクションおよび他のウイルス送達ベクターとは対照的に、タンパク質エレクトロポレーションと同様に、ナノブレードは、導入遺伝子を含まない方法でCas9/sgRNA RNAを一過性送達するという利点を有する。ナノブレードは、拡大し続けるCRISPRバリアントファミリーに簡単かつ迅速に適合させることができる、タンパク質送達のための非常に汎用性が高く、シンプルで安価なプラットフォームを提供します。ナノブレードは、HEK293T細胞株またはその誘導体において製造することができる。ここで使用されるHEK293T細胞株は、レトロウイルスおよびレンチウイルス粒子産生を最大化するために開発されている( 材料表を参照のこと)。しかしながら、HEK293T細胞の他の供給源が適しているかもしれないが、HEK293T細胞源によって粒子産生における大きな違いが観察されているため、ユーザーは異なる供給源からのHEK293T細胞を試験および比較しなければならない。また、細胞はマイコプラズマ汚染を頻繁にチェックし、粒子産生に悪影響を及ぼす過剰合流を避けるために3日ごとに継代(古典的には1/8希釈)する必要があります。
細胞は20回以上の継代にわたって維持されるべきではない。グルコース、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン、および10%脱相補ウシ胎児血清を添加したDMEMを細胞培養に使用した。血清起源はナノブレード製剤の品質に影響を与える可能性があるため、大規模生産の前に異なるバッチの血清を試験する必要があります。ナノブレードは、RPMIなどの他の培地、またはトランスフェクションの翌日にDMEMを置き換えることができる最小限の必須培地の無血清修飾で効率的に製造することができます。以下に示すように、トランスフェクション後の培地置換はいくつかのDNAトランスフェクション試薬による任意であるが、VLPが放出される培地を改変することは、特に粒子調製物中の血清微量を制限するために有益であり得る。しかしながら、トランスフェクションの前日に低血清最小必須培地で細胞を培養することは未だ試みられていない。
前述のように、ナノブレードは、産生細胞におけるプラスミドの混合物の過剰発現時に産生される。過剰発現は、最適な生産のために必要であるように思われる。実際、この研究室では、Gag-Pol発現コンストラクトが抗生物質選択によって安定化された産生細胞株を開発しました。しかし、このシステムは大量のナノブレードを生産できませんでした。sgRNAコード構築物が産生細胞のゲノムに安定に組み込まれた場合にも同様の観察が行われた。他の粒子産生系について記載されるように、ナノブレード産生に関与する少なくともいくつかの構築物を発現する安定な細胞株が有用であり得る;しかし、これには確かに大量の上清の処理と粒子を精製するための適切な技術が必要です。上記のプロトコルは、特定のトランスフェクション試薬を利用するナノブレードを製造するための好ましい手順を概説しています( 材料表を参照)。
他のメーカーのトランスフェクション試薬も成功裏にテストされていますが、ナノブレードを使用したこのグループの結果の大部分は、ここに記載されている手順に従います。リン酸カルシウム試薬を使用して低コストのトランスフェクションを達成し、良好な生産効率を得ることができます。しかしながら、この方法は、トランスフェクションの翌日にトランスフェクション培地の交換を絶対に必要とし、沈降粒子調製物中にリン酸カルシウム残基を残す可能性がある。産生細胞内でのナノブレード成分の高発現レベルの必要性と一致するのは、Cas9タンパク質に関連するsgRNAの量が効率的なゲノム編集のための制限因子となり得るという観察である。sgRNAローディングを改善するために、ナノブレードに類似したタンパク質送達ベクターを使用する独立したグループによって、2つの技術的アプローチが最近開発されている。これらは、sgRNA6のT7ポリメラーゼ依存性細胞質発現の使用、またはGagポリタンパク質6への結合を媒介するsgRNA配列へのレトロウイルス捕捉シグナルの付加に依存している。これらのアプローチは、ナノブレード内のsgRNAローディングを実際に改善する可能性がありますが、まだテストされていません。
標的細胞の形質導入は、この手順における重要なステップである。ほとんどの不死化細胞株において、ナノブレードによる形質導入は、細胞変性効果をほとんどまたは全く有さない。しかし、初代細胞では、毒性が問題になる可能性があります。したがって、形質導入は細胞タイプごとに最適化されなければならない。具体的には、ナノブレードへの曝露時間は、形質導入プロトコルを最適化する際に変更する重要な要素である。初代ニューロンや骨髄細胞などの敏感な細胞の場合、培地を交換する前にNanobladesで4〜6時間インキュベーションすることで、細胞毒性を最小限に抑えながらCas9タンパク質を効率的に送達できます。さらに、カチオン性ポリマーなどのアジュバントは、とりわけ、いくつかの細胞における形質導入の効率を有意に改善することができる( 材料表を参照のこと)。ナノブレードはVLPであり、免疫原性応答を誘導することができることに注意することが重要です。これは、マクロファージや樹状細胞などの特定のタイプの初代細胞で作業する場合、ナノブレードとのインキュベーションが遺伝子発現および細胞の表現型に重要な変化を誘導する場合、制限となり得る。マクロファージおよび樹状細胞が造血幹細胞前駆体(マウス骨髄細胞など)に由来する場合、ナノブレードに対する細胞応答を誘導することを避けるために、細胞が完全に分化する前にナノブレードで形質導入することが好ましい。さもなければ、Cas9タンパク質エレクトロポレーションは、分化した免疫細胞を扱う際に実行可能な代替手段を表すことができる。
ナノブレードは、インビボでマウス接合体または胚を形質導入してトランスジェニック動物を生成するために使用することができる。古典的なレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターと同様に、成体動物由来の組織に直接注射することもできる。しかしながら、ナノブレード(レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターに類似)は、宿主動物の免疫応答によって不活性化され得る。したがって、注射する用量は、アプリケーションごとに最適化する必要があります。この免疫応答はまた、注射部位に近い組織への機能的VLPの分布を制限することができる。最後に、レンチウイルスベクターとは異なり、ナノブレードは導入遺伝子フリーであり、限られた時間枠でCas9を送達する。したがって、細胞の選択時にsgRNAのハイスループットシーケンシングを必要とするゲノムワイドな機能スクリーニングの実行には使用できません。ナノブレードは、迅速で用量依存的で、導入遺伝子を含まないゲノム編集が必要な場合に有用です20。さらに、タンパク質エレクトロポレーションと同様に、ナノブレードは、DNAトランスフェクションまたは古典的なウイルスベクターを介したCas9/sgRNAの長期発現よりもオフターゲット効果が少なくなります3。ナノブレードの将来の開発は、塩基編集やRNAターゲティングなどのさまざまな技術アプリケーション向けにCas9バリアントを組み込むことに焦点を当てています。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、フランス国立研究庁(ANR)、フィノヴィ財団、Agence Nationale des Recherches sur SIDA et les Hépatites Viloles(ANRS-ECTZ3306)、および欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムの下での欧州研究評議会(ERC-StG-LS6-805500からE.P.R.)が運営するプログラムInvestissements d’Avenir(ANR-11-IDEX-0007)内のLabex Ecofect(ANR-11-LABX-0048)によって資金提供されました。
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |