我们开发了一种简单且廉价的方案,可在病毒样颗粒中加载Cas9 /单向导RNA(sgRNA)核糖核蛋白复合物。这些被称为”纳米刀片”的颗粒允许在不朽和原代细胞以及体内有效地递送Cas9 / sgRNA复合物。
簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统使真核细胞中的基因组编辑民主化,并导致了许多创新应用的发展。然而,将Cas9蛋白和单向导RNA(sgRNA)递送到靶细胞中在技术上可能是一个挑战。经典的病毒载体,例如来自慢病毒(LVs)或腺相关病毒(AAV)的载体,允许在许多原代细胞和体内有效地递送编码Cas9蛋白及其相关sgRNA的转基因。然而,这些载体可能遭受缺点,例如转基因在靶细胞基因组中的整合,有限的载货容量以及Cas9蛋白和指导RNA在靶细胞中的长期表达。
为了克服其中一些问题,开发了一种基于小鼠白血病病毒(MLV)的递送载体,以在没有任何编码转基因的情况下包装Cas9蛋白及其相关的引导RNA。通过将Cas9蛋白融合到MLV结构蛋白Gag的C端,形成了加载了Cas9蛋白和sgRNA(称为”纳米刀片”)的病毒样颗粒(VLP)。可以从生产者细胞的培养基中收集纳米片,纯化,定量,并用于转导靶细胞并递送活性Cas9 / sgRNA复合物。纳米刀片在各种原代和不朽细胞中瞬时和快速地传递其核糖核蛋白(RNP)货物,并且可以针对其他应用进行编程,例如使用修饰的Cas9蛋白对靶基因的瞬时转录激活进行编程。纳米刀片能够在注射的成年小鼠的肝脏和卵母细胞中进行体内基因组编辑,以产生转基因动物。最后,它们可以与供体DNA复合,以实现”无转染”的同源性定向修复。纳米叶片制备简单,成本相对较低,可以在任何细胞生物学实验室中轻松进行。
与其他可编程核酸酶相比,CRISPR-Cas系统极大地简化和民主化了真核细胞中序列特异性基因组靶向和切割的过程。通过sgRNA的简单表达,用户可以为几乎任何细胞位点编程Cas9蛋白(或优化的变体1)。在这种情况下,Cas9蛋白和sgRNA的递送成为进行位点导向诱变时的主要限制。在永生化细胞中,sgRNA和Cas蛋白可以很容易地从转染的质粒中表达,从而在大多数细胞中实现有效的基因组靶向。然而,Cas9/sgRNA复合物的本构表达可以增加Cas9蛋白的脱靶活性,并在非特异性位点2中引入不希望的变化。在原代细胞中,DNA转染在技术上可能难以实现,并导致表达不良或转染细胞的一小部分。经典DNA转染的替代方案包括使用病毒载体,提供Cas9和sgRNA的转基因编码或与合成sgRNA偶联的重组Cas9蛋白的电穿孔。然而,这些方法可导致细胞宿主基因组内的转基因整合(如经典的逆转录病毒和慢病毒表达载体的情况),受细胞因子的限制,并导致Cas9蛋白和sgRNA的本构表达。
Cas9 / sgRNA RNP复合物的电穿孔可以克服大多数这些问题,并导致原代细胞和体内的有效和瞬时递送,并允许剂量依赖性反应。然而,它通常依赖于昂贵的设备和试剂,并且如果必须处理大量细胞,也很难升级。作为上述技术的替代方案,这些作者开发了”Nanoblades”——一种用于Cas9蛋白和sgRNA3的逆转录病毒递送载体,在概念上与其他病毒衍生的衣壳蛋白递送系统相似4,5,6,7,8。纳米刀片利用逆转录病毒中Gag多蛋白的天然能力,当在培养细胞中单独表达时,产生在细胞外培养基中释放的VLP9。通过将Cas9蛋白融合到小鼠白血病病毒(MLV)Gag多蛋白的C端并共表达sgRNA和病毒包膜糖蛋白,Cas9蛋白可以封装在释放的VLP或纳米片内。纯化后,纳米片可以与靶细胞一起孵育或注射到体内,以介导Cas9 / sgRNA RNP复合物的快速,瞬态和剂量依赖性递送3。
纳米刀片可以使用多个sgRNA进行编程,以便在不同位点同时进行编辑,也可以使用Cas9变体进行编程以执行其他应用,例如靶标特异性转录激活或抑制3。与依赖于重组表达的蛋白质电穿孔相反,文献中新描述的Cas变体可以很容易地克隆到Gag融合表达载体中,使其成为一个多功能平台。纳米叶片可以进一步络合或装载单链和双链寡脱氧核苷酸(ssODN)以执行同源定向修复3。纳米刀片生产相对简单且便宜。此外,纳米叶片可以在4°C下储存多年,或在-80°C下长期储存。通常,纳米刀片在大多数永生化和原代培养的细胞中介导高效,无转基因的基因组编辑。然而,一些原代细胞可能对病毒颗粒的存在敏感,导致死亡率增加。先天免疫系统的细胞也可以对纳米叶片的存在做出反应(因为它们的病毒来源)并被激活。在这些情况下,必须优化转导方案,以限制纳米叶片的暴露时间并最大限度地减少非特异性影响。纳米刀片代表了其他可用CRISPR递送方法的可行且易于实施的替代方案。
纳米刀片允许在细胞系和原代细胞中快速和剂量依赖性地递送Cas9 / sgRNA RNP复合物。与经典转染和其他病毒递送载体相比,但与蛋白质电穿孔一样,Nanoblades具有以无转基因方式瞬时递送Cas9 / sgRNA RNP的优势。Nanoblades为蛋白质递送提供了一个高度通用,简单且廉价的平台,可以轻松快速地适应不断扩大的CRISPR变体家族。纳米刀片可以在HEK293T细胞系或其衍生物中生产。这里使用的HEK293T细胞系已被开发用于最大限度地提高逆转录病毒和慢病毒颗粒的产生(见 材料表)。然而,尽管HEK293T电池的其他来源可能适用,但用户必须测试和比较来自不同来源的HEK293T电池,因为根据HEK293T电池来源,已经观察到颗粒产生的主要差异。细胞还必须经常检查支原体污染,并每三天传代一次(通常为1/8稀释),以避免过度融合,这对颗粒产生产生负面影响。
细胞不应维持超过20次传代。补充葡萄糖、青霉素/链霉素、谷氨酰胺和10%分解胎牛血清的DMEM用于细胞培养。由于血清来源可能会影响纳米刀片制剂的质量,因此在大规模生产之前应测试不同批次的血清。纳米片可以在其他培养基中有效生产,例如RPMI或最小必需培养基的无血清修饰,可以在转染后的第二天取代DMEM。如下所述,尽管用某些DNA转染试剂转染后替代培养基是可选的,但修饰VLP释放到的培养基中可能是有益的,特别是为了限制颗粒制备中的血清痕量。然而,尚未尝试在转染前一天在低血清最低必需培养基中培养细胞。
如前所述,纳米片是在生产者细胞中质粒混合物过表达时产生的。过度表达似乎是最佳生产所必需的。事实上,该实验室开发了一种生产者细胞系,其中Gag-Pol表达构建体通过抗生素选择稳定;然而,该系统未能产生大量的纳米叶片。当sgRNA编码构建体稳定地整合到生产者细胞的基因组中时,也进行了类似的观察。如其他颗粒生产系统所述,表达至少一些参与纳米叶片生产的构建体的稳定细胞系可能是有用的;然而,这肯定需要处理大量的上清液和适当的技术来纯化颗粒。上述方案概述了利用特定转染试剂生产纳米片的首选程序(见 材料表)。
尽管来自其他制造商的转染试剂也已成功测试,但该组使用纳米刀片的绝大多数结果都遵循本文所述的程序。使用磷酸钙试剂可实现低成本转染,产生良好的生产效率;然而,这种方法绝对需要在转染后的第二天更换转染培养基,并可能在沉淀颗粒制备中留下磷酸钙残留物。与生产者细胞内纳米刃组分高表达水平的必要性相一致的是,与Cas9蛋白相关的sgRNA的量可能是有效基因组编辑的限制因素。为了改善sgRNA负载,独立小组最近开发了两种技术方法,使用类似于Nanoblades的蛋白质递送载体。这些依赖于使用sgRNA6的T7聚合酶依赖性细胞质表达或通过向sgRNA序列添加逆转录病毒封装信号来介导与Gag多蛋白6的结合。这些方法确实可以改善Nanoblades内的sgRNA负载,尽管它们尚未经过测试。
靶细胞的转导是该过程的关键步骤。在大多数永生化细胞系中,用纳米刀片转导具有很少或没有细胞病变作用。然而,在原代细胞中,毒性可能是一个问题。因此,转导必须针对每种细胞类型进行优化。具体而言,在优化转导协议时,纳米刀片的暴露时间是需要修改的重要因素。对于敏感细胞,如原代神经元或骨髓细胞,在更换培养基之前用纳米刀片孵育4-6小时可以有效地递送Cas9蛋白,同时最大限度地减少细胞毒性。此外,阳离子聚合物等佐剂可以显着提高某些电池的转导效率(见 材料表)。重要的是要注意,纳米刀片是VLP,可以诱导免疫原性反应。如果与某些类型的原代细胞(例如巨噬细胞或树突状细胞)一起工作,这可能是一个限制,其中与Nanoblades的孵育可以诱导基因表达和细胞表型的重要变化。如果巨噬细胞和树突状细胞来自造血干细胞前体(如小鼠骨髓细胞),则优选在它们完全分化之前用纳米片转导细胞,以避免诱导对纳米叶片的细胞反应。否则,Cas9蛋白电穿孔在处理分化的免疫细胞时可能是一种可行的替代方案。
纳米刀片可以在体内用于转导小鼠受精卵或胚胎以产生转基因动物。与经典的逆转录病毒或慢病毒载体类似,它们也可以直接注射到成年动物的组织中。然而,纳米刀片(类似于逆转录病毒和慢病毒载体)可以被宿主动物的免疫反应灭活;因此,必须针对每种应用优化注射剂量。这种免疫反应还可以限制功能性VLP在靠近注射部位的组织中的分布。最后,与慢病毒载体不同,Nanoblades是无转基因的,并且在有限的时间范围内递送Cas9。因此,它们不能用于进行全基因组功能筛选,这些筛选需要在选择细胞时对sgRNA进行高通量测序。当需要快速、剂量依赖性和无转基因基因组编辑时,纳米刀片是有用的20。此外,与蛋白质电穿孔类似,与通过DNA转染或经典病毒载体延长表达Cas9 / sgRNA相比,纳米片的脱靶效应更少3。Nanoblades的未来发展重点是将Cas9变体整合到不同的技术应用中,例如碱基编辑和RNA靶向。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由里昂大学的Labex Ecofect(ANR-11-LABX-0048)资助,由法国国家研究机构(ANR),FINOVI基金会,国家研究机构和病毒研究基金会(ANRS-ECTZ3306)和欧洲研究理事会(ERC-StG-LS6-805500至E.P.R.)根据欧盟的地平线2020研究和创新计划运营。
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |