此协议的目标是使用组装的核糖核蛋白复合物和dpy-10共同 CRISPR 标记进行无缝的 CRISPR/Cas9 编辑,以便进行筛选。 此协议可用于在C. elegans中进行各种基因修改,包括插入、删除、基因替换和 codon 替代。
研究人员利用细菌聚集定期间短白细胞重复(CRISPR)/链球菌PYogenesCRISPR相关蛋白质(Cas)系统来研究重要的生物学相关问题。CRISPR/Cas基因组编辑方法的无与伦比的力量使研究人员能够精确编辑他们选择的任何部位,从而促进对基因功能的了解。以前曾描述过由CRISPR/Cas9编辑C.elegans基因组的几种方法。在这里,我们讨论和演示一种方法,利用体外组装的核糖核蛋白复合物和dpy-10共同CRISPR标记进行筛选。具体来说,在本文中,我们通过同源定向修复,使用CRISPR/Cas9编辑方法,逐步将过早停止的codon引入C.elegans rbm-3.2基因。这种相对简单的编辑方法可用于研究任何感兴趣的基因的功能,并允许CRISPR/Cas9编辑在不到两周的时间内生成同源编辑的C.elegans。
聚类定期间歇性短白细胞重复(CRISPR)/链球菌皮质CRISPR相关蛋白质(Cas)技术能够在各种生物体1,2,3,4中实现高效的靶向基因组编辑。CRISPR系统最初被发现作为原病毒抗病毒免疫反应5,6,7的一部分。II 型 CRISPR 系统使用内窥酮夹板,如 Cas9, 转活RNA(跟踪RNA)和短,目标DNA特异性20核苷酸长导CRISPRRNA(crRNA)识别”NGG”原位空间相邻的Motif(PAM),并在目标DNA5,6,7,8,9,10,11,12双链断裂。这种双链断裂被细胞DNA修复机械确认为病变。因此,生成的双链断裂可以通过两个路径之一修复 – i) 非同源端连接 (NHEJ) 或 ii) 同源定向修复 (HDR)13。NHEJ 经常容易出错,因此,当此通路用于修复目标 DNA 中的双链断裂时,它通常会导致感兴趣的基因中灭活突变(插入、删除)。另一方面,通过向双链断裂的两侧提供具有同源性外源修复模板,细胞DNA修复机械可以指示使用 HDR 修复断裂13。因此,HDR 方法能够精确编辑任何感兴趣的地点。
各种CRISPR/Cas9基因编辑协议已经描述了C.elegans14,15,16,17,18,19,20。在C.elegans最常用的CRISPR/Cas9编辑方法包括基于克隆和无克隆的协议,以生成CRISPR/Cas9编辑14,15,16,17,18,19,20的修复模板。本协议详细讨论了基于使用dpy-10作为筛选共同 CRISPR 标记的无克隆 CRISPR/Cas9 编辑协议。到目前为止,唯一详细的C.elegans为重点的CRISPR/Cas9编辑视频协议存在使用荧光标记筛选21。然而,使用荧光标记进行筛查需要使用荧光显微镜,小型本科院校 (PUI) 的许多实验室可能发现很难访问荧光显微镜。令人鼓舞的是,在先前的研究中,携带荧光标记的蠕虫与编辑21、22的存在之间取得了积极的相关结果。但是,需要进行额外的研究,以确定基于荧光的筛选方法的整体效率,以便使用不同的指南RNA和修复模板编辑各种 loci。最后,由于这些荧光标记的质粒编码形成外色体阵列,变荧光通常由这些阵列产生,使阳性难以识别23。因此,虽然基于荧光的筛选方法可能很有用,但上述问题可能会限制其适用性。
使用产生可见表型的共CRISPR标记,可大大减少需要筛选的后代数量,以找到积极编辑的蠕虫23,24,25,26,27,28。重要的是,这些标记产生的表型很容易在简单的解剖显微镜下检测到23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34。dpy-10共CRISPR标记是性能最佳和广泛使用的共CRISPR标记之一,用于执行C.埃莱甘SCRISPR/Cas9基因组编辑24,27。 因此,本文将讨论使用直接交付核糖核蛋白复合物与dpy-10作为共同CRISPR标记27,35在C.elegans执行CRISPR/Cas9编辑的方法。在这种方法中,准备的编辑注射组合包括一个特征良好的dpy-10 crRNA和dpy-10修复模板,以调解一个可观察到的显性”滚筒”(Rol)表型的生成,这是由已知的异质dpy-10(cn64)突变在dpy-10基因24,27,29。当存在同源状态时,dpy-10(cn64)突变会导致一种垃圾(dpy)表型,从而产生更短和更笨重的蠕虫24,29。Rol 表型通过 HDR 介导的 CRISPR/Cas9 编辑将共同提供的dpy-10修复模板准确插入dpy-10基因的单个副本进行介导。因此,Rol C. elegans的出现表明注射成功,以及注射蠕虫细胞内成功进行 HDR 介质编辑事件。由于目标基因的 crRNA 和修复模板与dpy-10 crRNA 和dpy-10修复模板处于相同的注射组合中,因此确定的 Rol 蠕虫很有可能也同时在感兴趣的目标基因上进行编辑。因此,这些 Rol 蠕虫随后通过聚合酶链式反应 (PCR) (用于大于 50 bp 的编辑) 或 PCR,然后是限制消化(用于小于 50 bp 的编辑)等技术筛选出感兴趣的编辑。
使用这种方法进行基因组编辑的优点是:(一)CRISPR编辑可以以相对较高的效率(2%至70%)使用这种方法产生27:ii) 本方法中使用的修复模板和指南RNA不涉及克隆,从而缩短了其生成所需的时间:iii) 通过在体外组装核糖核蛋白复合物,可以保持组装编辑复合物的浓度相对恒定,从而提高可重复性:iv) 一些指南RNA,当从质粒表达时无法生成编辑已被证明适用于CRISPR/Cas9基因组编辑时,提供体外转录crnas27:v) 包括dpy-10共 CRISPR 标记,便于使用解剖显微镜进行筛查,并减少必须筛查的后代数量,以找到阳性24、27:和vi)DNA测序验证同源编辑蠕虫线可以通过这种方法在几周内获得19,27。
与许多不同的C.elegansCRISPR方法有关的优秀书籍章节已经出版了14,15,16,17,18,19,20,43。然而,目前缺乏在实验室环境中以视频格式演示dpy-10共同 CRISPR 方法。在本文中,我们描述并演示了使用dpy-10共 CRISPR 方法编辑一种名为rbm-3.2的代表性目标基因的过程,该基因是一种假定RNA结合蛋白(蠕虫基:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10)。 具体来说,在这里,我们详细描述了使用体外组装的核糖核蛋白复合物和外源性提供的线性单链修复模板,在C.elegans rbm-3.2基因中引入三个过早停止胶点的方法。这些研究已经成功地产生了第一个C.elegansCRISPR菌株与过早停止在rbm-3.2基因。由于目前对这种基因在C.elegans中的功能知之甚少,这种菌株将成为解剖人民币-3.2功能的有用工具。这种方法也可以在C.elegans基因组中的任何位点进行插入、替换和删除。
除了 rbm-3.2 之外,我们还使用上述协议编辑了几个基因。我们针对不同 loci、指南 RNA 和修复模板(单链和双链)的编辑效率在 2% 到 58% 之间(未显示数据)。所观察到的编辑效率可与本协议27 之前报告的编辑效率 2% 至 70% 相媲美。我们还成功地利用这种技术进行基因缺失。使用两个 crRNA,我们用绿色荧光蛋白 (GFP) 的编码序列(未显示数据)替换了长度接近 6 kb 的基因。对于这个实验,大约14%的Rol F1 蠕虫被分析发现对基因删除和GFP的替代是积极的(数据没有显示)。但是,还需要进行额外的实验,以确定使用此技术可以执行的基因缺失和替换的最大长度。
这种技术可用于使插入约1.6千瓦的长度19。最近的一项研究表明,使用此协议进行长度超过 1.6 kb 的插入,生成两个双链断裂,并使用具有较长同源臂的修复模板,可以插入更大的 DNA 片段 (+10 Kb)28。或者,可以执行此协议的多轮基因编辑以生成更大的编辑。其他基于质粒的C.elegansCRISPR/Cas9基因编辑协议也可以用于CRISPR实验,涉及插入大于1.6kb46,47,48的DNA片段。
在使用此协议进行基因编辑之前,必须确保感兴趣的基因与染色体 II 上的dpy-10位点无关。如果目标基因与dpy-10相关联,将dpy-10突变从您的兴趣编辑中分离出去可能会有问题。因此,如果感兴趣的基因与dpy-10位点有关, 其他共同CRISPR标记,如unc-58 (X染色体),unc-22或禅-4 (染色体IV),和ben-1或pha-1 (染色体 III) 位于不同的染色体上, 可以使用24,25,26,28. 。来自迈耶实验室的数据表明,本-1和Zen-4突变可以用作成功的共同CRISPR标记,用这种方法28进行筛选。然而,重要的是要注意,使用禅-4和pha-1作为共同CRISPR标记,需要分别在非野生型禅-4(cle10ts)或pha-1(e2123ts)背景中分别进行CRISPR实验26、28。此外,CRISPR实验涉及一些共同CRISPR标记,如ben-1可能需要准备特殊的板(如含有苯二甲酰基苯甲酸乙酰)28。我们已成功使用unc-58共 CRISPR 标记屏蔽使用此方法与dpy-10关联的基因的正向编辑(未显示数据)。unc-58(e665)突变赋予了可见表型(瘫痪),可以有效地用于筛选积极编辑的蠕虫24。或者,如果可以使用荧光显微镜,荧光标记的gtbp-1基因也可以用作此协议19的共同CRISPR标记。
为了在使用这种基因组编辑方法时获得高编辑效率,编辑站点必须在 Cas9 切割站点的 10 到 30 个碱基内。如果编辑站点距离 Cas9 切割站点超过 30 个基数,则编辑效率将大幅下降 19、35、37。然而,迈耶实验室最近的一项研究表明,利用此协议28在彼此距离处创建两个双链断层可以插入远离 Cas9 切割站点的编辑。
在当前协议中,修复模板被设计为使所有三个插入的停止 codon 都显示在同一读取帧中。然而,另一种策略,创造空突变体将是使用通用的43基地长敲击STOP-IN盒式磁带,已经描述了以前50。重要的是,这盒盒式磁带在所有三种可能的阅读帧中都停止了 codons,并导致帧移位突变。当编辑站点发生不当或不完整的修复时,这是生成空突变体的特别有用的策略。
总之,由于其持续时间短和最近这一方法的进步,这是一个很好的方法,为常规实验室实验涉及添加短免疫性表同体标签,荧光标签,使基因删除,基因替代和科顿替代。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了塔尔萨大学(TU)启动基金和TU学院发展暑期奖学金的支持,该奖学金授予了Jyoti Iyer。我们要感谢化学暑期本科研究计划(CSURP)和塔尔萨本科研究挑战赛(TURC)为参与这项研究的学生发放津贴。我们要感谢卡罗琳·邓恩女士的技术援助。最后,我们要感谢乔丹·沃德博士、艾美·贾拉米洛-兰伯特博士、安娜·艾伦博士、罗伯特·希夫博士、威廉·波特博士和赛利·莫格博士对这份手稿的批判性评论。
Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
ECoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |