In vivo-avbildning är ett kraftfullt verktyg för studier av biologi vid hälsa och sjukdom. Detta protokoll beskriver transpupillär avbildning av musens näthinna med ett standard tvåfotonmikroskop. Det visar också olika in vivoimaging-metoder för att fluorescerande märka flera cellulära kohorter i näthinnan.
Näthinnan omvandlar ljussignaler från omgivningen till elektriska signaler som sprids till hjärnan. Sjukdomar i näthinnan är vanliga och orsakar synskador och blindhet. Att förstå hur sådana sjukdomar utvecklas är avgörande för att formulera nya behandlingar. In vivo-mikroskopi i djurmodeller av sjukdom är ett kraftfullt verktyg för att förstå neurodegeneration och har lett till viktiga framsteg mot behandlingar av tillstånd som sträcker sig från Alzheimers sjukdom till stroke. Med tanke på att näthinnan är den enda strukturen i centrala nervsystemet som i sig är tillgänglig genom optiska tillvägagångssätt, lämpar den sig naturligtvis för in vivo-avbildning. Den inbyggda optiken i linsen och hornhinnan utgör dock vissa utmaningar för effektiv bildåtkomst.
Detta protokoll beskriver metoder för in vivo tvåfotonavbildning av cellulära kohorter och strukturer i musens näthinna vid cellulär upplösning, tillämplig för både akut- och kronisk varaktighetsavbildningsexperiment. Den presenterar exempel på retinal ganglioncell (RGC), amakrin cell, mikroglial och vaskulär avbildning med hjälp av en serie märkningstekniker inklusive adenoassocierade virus (AAV) vektorer, transgena möss och oorganiska färgämnen. Det är viktigt att dessa tekniker sträcker sig till alla celltyper i näthinnan, och föreslagna metoder för att komma åt andra cellulära populationer av intresse beskrivs. Detaljerade är också exempelstrategier för manuell bildbehandling för visning och kvantifiering. Dessa tekniker är direkt tillämpliga på studier av näthinnans funktion vid hälsa och sjukdom.
In vivo-visualisering av centrala nervsystemet kräver i allmänhet invasiva procedurer som skallförtunning och installation av glasfönster eller optiska relälinser. Näthinnan är den enda strukturen i nervsystemet som kan observeras direkt utan behov av invasiv beredning eftersom den naturligt tar emot ljus från miljön. Den enkla optiska åtkomsten till näthinnan gör det till ett attraktivt modellsystem för att studera centrala nervsystemet.
Levande fluorescerande avbildning av näthinnan hos möss har använts för att spåra RGC-död i modeller av glaukom 1,2, optisk nervskada 1,3,4 ochstroke 5, samt förändringar i mikroglialaktivering 6,7,8 och vaskulatur 9 under degenerativa tillstånd. Inneboende signaler kan också användas för att visualisera fotoreceptorer 10,11,12 och retinala pigmentepitelceller 13. Många metoder för in vivo-avbildning av näthinnan använder antingen högspecialiserade enheter som är speciellt utformade för oftalmologiska ändamål6 eller mycket modifierade optiska system för att korrigera för hornhinnans och linsens ursprungliga avvikelser 8,9,11,12,13,14.
Detta protokoll visar ett tillvägagångssätt för in vivo-avbildning av fluorescerande signaler i näthinnan vid cellulär upplösning, med hjälp av en grundläggande metod för delvis korrigering för musögats främre optik. Denna strategi kräver mycket små anpassningar av multifotonmikroskopinställningar som vanligtvis används för in vivo-avbildning av hjärnan. Eftersom detta tillvägagångssätt är enkelt att ställa in, och mössen är under liten stress, bidrar det till att utföra time-lapse-experiment under både akuta och kroniska varaktigheter. Dessutom är genetiska och organiska färgämnesbaserade procedurer som märker enskilda retinala komponenter, inklusive RGCs, amakrina celler, microglia och vaskulatur, kompatibla med denna avbildningsteknik och möjliggör in vivo-observation av celltyper och strukturer som är kritiska för retinal funktion. Dessa verktyg kan anpassas för att märka de flesta andra neuronala celltyper samt gliala och vaskulära komponenter i näthinnan.
Tvåfotonavbildningsproceduren som beskrivs häri möjliggör longitudinell in vivo-avbildning av musens näthinna. Repeterbara bilder av samma näthinneregion kan erhållas under en kontinuerlig period på upp till 6 eller mer h under isofluran. Musen kan också avbildas på olika dagar med hjälp av cellulära och vaskulära landmärken för att lokalisera samma bildområde (figur 3). Användningen av en klar gelfördjupning i kombination med täckglas för detta ändamål har tidigare tillämpats på en rad procedurer, inklusive visualisering av näthinnan för subretinal injektion, laserinducerade retinala skademodeller och fundusavbildning20,21,22.
Ögats anatomi innebär unika utmaningar för in vivo-avbildning, eftersom den höga optiska kraften hos mushornhinnan och linsen hindrar direkt avbildning genom pupillen utan korrigering. Flera andra in vivo-avbildningsmetoder förlitar sig på användningen av en plano-konkav kontaktlins för korrigering av musögats främre optik 7,17,18,19. Med endast optisk korrigering vid hornhinnan resulterar muslinsens höga optiska effekt i en oundviklig mängd parallax, särskilt av strukturer i det perifera skanningsfältet, vilket manifesteras som sträckning och translationell rörelse i X-Y-dimensionen vid olika Z-plan. För att minimera bildparallaxrelaterad distorsion i X- och Y-dimensioner är det avgörande att musögat är orienterat så att tangentplanet till näthinnan vid bildområdet är vinkelrätt mot mikroskopets ljusväg. Inställningen som beskrivs här bidrar till exakt manipulation av ögonvinkeln för att uppnå denna inriktning. En justerbar mushuvudhållare som tillåter rotation längs två axlar möjliggör enkla manuella justeringar av ögonvinkeln när experimenteraren bläddrar genom Z-dimensionen för att minimera parallax. Denna lutning kringgår också pupillens fältstoppseffekt för att möjliggöra avbildning av större områden i näthinnan. Huvudhållarens fasthållning minskar också kraftigt rörelseartefakter orsakade av andning.
Försiktighet måste vidtas för att upprätthålla klarheten i musögat, eftersom bildkvaliteten försämras med opacifiering under kontinuerlig avbildning. Frekvent applicering av smörjmedelsgel under avbildning och salva applicering efter varje bildsession hjälper till att förhindra att ögat torkar och utvecklar opaciteter. Vissa hornhinnoropaciteter kommer spontant att lösa sig efter 24-48 timmar. Användningen av klar gel och täckglas som beskrivs i detta protokoll ger liknande bildkvalitet och aberrationskorrigering som en kontaktlins7, samtidigt som det möjliggör enklare justeringar av ögonvinkeln utan att behöva justera täckglaset igen. Dessutom ger gelén kontinuerlig hydrering till ögat, vilket gör det möjligt att utföra akuta avbildningssessioner på upp till flera timmar. Slutligen, eftersom täckglaset inte kommer i kontakt med hornhinnan, orsakar det minimal irritation i ögat som kan minska optisk klarhet för upprepade bildsessioner.
En begränsning av detta tillvägagångssätt är det faktum att optiska avvikelser inte är helt korrigerade. Medan detta allvarligt minskar axiell upplösning på grund av den tunga parallaxen, kan kvantitativa mätningar av soma erhållas i enbildsplan. Det bör noteras att eftersom fluorescenssignalintensiteten hos retinala neuroner är beroende av provjustering med denna metod, är excitations- och emissionskvotmetriska baserade sensorer mer lämpliga för experiment som jämför prover kroniskt över olika bildsessioner. Ett tillvägagångssätt för att korrigera optiska avvikelser på systemnivå är adaptiv optik, vilket möjliggör subcellulär upplösning i näthinnan 8,9,14,21. Adaptiv optik kräver dock högspecialiserad utrustning och omfattande expertis att implementera.
Alternativa tillvägagångssätt för tvåfotoner in vivo retinal avbildning är konfokalmikroskopi eller oftalmoskopi6. Det tillvägagångssätt som presenteras här bör vara lätt att översätta till widefield- eller konfokalmikroskopi. Enkel fotonavbildning är kanske mer robust och utgör mindre risk att skada näthinnan på grund av hög energi hos den tvåfotonlaser som krävs för att uppnå effektiv tvåfotoneffekt genom hornhinnan och linsen i ögat. För att undvika laserskador med två fotoner bör tröskeln för maximal lasereffekt bestämmas empiriskt genom att undersöka helmonterade näthinnor efter avslutad avbildningsexperiment och immunfärgning för celltyper i de avbildade skikten. I systemet som presenteras här märktes RGCs med pan-RGC-markören, Rbpms, och densiteter var normala upp till 45 mW bildeffekt, medan 55 mW orsakade en betydande förlust av RGCs (visas inte).
En nackdel med enfotonavbildning är det faktum att detta tillvägagångssätt mycket kraftigt kommer att stimulera näthinnans inbyggda visuella kretsar jämfört med tvåfotonavbildning23. Tidigare experiment med retinala wholemounts eller ögonmusslor har visat att tvåfotonlaserskanning framkallar kretsaktivering som till stor del är övergående24. Här visar avbildning av RGC-aktivitet med Ca 2+ -sensorn Twitch2b att laserskanningens början inducerar Ca 2+ -höjder, som återgår till baslinjen under5-20 s i de flesta RGCs (Figur 8). Med tanke på att lasereffekten i detta protokoll ligger inom intervallet för tidigare experiment som rapporterar in vivo retinalt ljussvar8, är den för närvarande beskrivna metoden sannolikt mottaglig för inspelningar av kretsaktivitet i näthinnan. Sådana överväganden är viktiga för experiment som kan påverkas av kretsaktivitet.
Detta protokoll visar in vivo-avbildning av två typer av retinala neuroner, RGCs och amakrina celler. Liknande märkning av andra större celltyper kan uppnås, inklusive horisontella celler (Cx57-Cre 25), bipolära celler (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), konfotoreceptorer (S- eller M-opsin-Cre 28), stavfotoreceptorer (Nrl-Cre 29), Müller glia (Foxg1-Cre 26) och pericyter (NG2-DsRed9). Transgena möss är också tillgängliga för att märka diskreta delmängder av RGCs (t.ex. KCNG4-Cre för αRGCs30; OPN4-Cre för ipRGCs31; JAM-B-CreER för J-RGCs 32) och amakrina celler (t.ex. ChAT-Cre för starburst amacrine celler26 och neuropeptidpromotordrivrutiner för olika amakrina cellsubtyper 3,34). Virala vektorer kan användas för att rikta in sig på specifika cellpopulationer i stället för transgena möss. Intravitreala injektioner av AAV2 med ett allestädes närvarande CAG-promotorelement märker nästan uteslutande RGCs, amakrina celler och horisontella celler25. Parning av den modifierade AAV2.7m8-Y444F-kapsiden med en konstruerad mGluR6-promotorkonstruktion möjliggör bred märkning av ON bipolära celler35. Subretinala injektioner av AAV leder till en anrikning av fotoreceptorer, där serotyp AAV2/5 har den högsta transduktionseffektiviteten36. Shh10, ett modifierat AAV6-kapsidprotein, parat med glialfibrillära sura proteinpromotorelement har visat sig specifikt för Müller glia37.
Förmågan att observera celler i centrala nervsystemet med ett helt icke-invasivt tillvägagångssätt kan användas för att studera både grundläggande egenskaper hos neurala kretsar8, liksom mekanismer för neurodegeneration 3,4,5,6,38. Många bländande sjukdomar riktar sig mot cellulära populationer i näthinnan, och in vivo-avbildningsmetoder hos möss har använts för att studera optisk nervskada 1,3,4, makuladegeneration13, stroke5, glaukom 2,6 och uveit7. Dessutom manifesterar sig många neurodegenerativa tillstånd i centrala nervsystemet i näthinnan inklusive Alzheimers sjukdom39, multipel skleros40 och Parkinsons sjukdom41. Därför kan denna lättillgängliga teknik för in vivo-avbildning av näthinnan tillämpas som ett verktyg för att studera en bred uppsättning neurodegenerativa tillstånd.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award till P.R.W. och ett obegränsat bidrag till Institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper vid Washington University School of Medicine i St. Louis), National Glaucoma Research (ett program av BrightFocus Foundation) och McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. stöds av ett institutionellt nationellt forskningstjänstpris T32 EY013360. Detta arbete stöddes också av Hope Center Viral Vectors Core vid Washington University School of Medicine.
#1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
ChromoFlex – Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
Cling film | VWR | 10713-916 | |
Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
ImageJ Fiji software | Freeware | ||
Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |