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신경과학

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Published: February 13, 2021
doi:
10.3791/61970
, ,
1John F. Hardesty, MD Department of Ophthalmology and Visual Sciences,Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Neuroscience,Washington University School of Medicine, 3Department of Neuroscience,Washington University School of Medicine, 4Hope Center for Neurological Disorders,Washington University School of Medicine

Summary

L’imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l’imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Abstract

La retina trasforma i segnali luminosi dall’ambiente in segnali elettrici che vengono propagati al cervello. Le malattie della retina sono prevalenti e causano disabilità visiva e cecità. Capire come tali malattie progrediscono è fondamentale per formulare nuovi trattamenti. La microscopia in vivo in modelli animali di malattia è un potente strumento per comprendere la neurodegenerazione e ha portato a importanti progressi verso il trattamento di condizioni che vanno dal morbo di Alzheimer all’ictus. Dato che la retina è l’unica struttura del sistema nervoso centrale intrinsecamente accessibile da approcci ottici, si presta naturalmente all’imaging in vivo. Tuttavia, l’ottica nativa della lente e della cornea presenta alcune sfide per un accesso efficace alle immagini.

Questo protocollo delinea i metodi per l’imaging in vivo a due fotoni di coorti e strutture cellulari nella retina del topo a risoluzione cellulare, applicabile sia per esperimenti di imaging di durata acuta che cronica. Presenta esempi di cellule gangliari retiniche (RGC), cellule amacrine, microglia e imaging vascolare utilizzando una serie di tecniche di etichettatura tra cui vettori di virus adeno-associati (AAV), topi transgenici e coloranti inorganici. È importante sottolineare che queste tecniche si estendono a tutti i tipi di cellule della retina e vengono descritti i metodi suggeriti per accedere ad altre popolazioni cellulari di interesse. Vengono inoltre illustrate in dettaglio le strategie di esempio per la post-elaborazione manuale delle immagini per la visualizzazione e la quantificazione. Queste tecniche sono direttamente applicabili agli studi sulla funzione retinica in salute e malattia.

Introduction

La visualizzazione in vivo del sistema nervoso centrale richiede generalmente procedure invasive come l’assottigliamento del cranio e l’installazione di finestre di vetro o lenti a relè ottico. La retina è l’unica struttura del sistema nervoso che può essere osservata direttamente senza la necessità di una preparazione invasiva in quanto riceve nativamente luce dall’ambiente. La facilità di accesso ottico alla retina lo rende un sistema modello attraente per lo studio del sistema nervoso centrale.

L’imaging fluorescente dal vivo della retina nei topi è stato utilizzato per tracciare la morte RGC in modelli di glaucoma 1,2, danno del nervo ottico 1,3,4 e ictus5, nonché cambiamenti nell’attivazione microgliale 6,7,8 e nella vascolarizzazione 9 in condizioni degenerative. I segnali intrinseci possono anche essere utilizzati per visualizzare i fotorecettori 10,11,12 e le cellule epiteliali pigmentate retiniche 13. Molti approcci all’imaging in vivo della retina utilizzano dispositivi altamente specializzati specificamente progettati per scopi oftalmologici6 o sistemi ottici altamente modificati per correggere le aberrazioni native della cornea e del cristallino 8,9,11,12,13,14.

Il presente protocollo dimostra un approccio all’imaging in vivo di segnali fluorescenti nella retina a risoluzione cellulare, utilizzando un metodo di base per correggere parzialmente l’ottica anteriore dell’occhio del topo. Questa strategia richiede adattamenti molto minori alle configurazioni del microscopio multifotone che sono comunemente utilizzate per l’imaging in vivo del cervello. Poiché questo approccio è semplice da configurare e i topi sono sottoposti a poco stress, è favorevole eseguire esperimenti time-lapse su entrambe le durate acute e croniche. Inoltre, le procedure genetiche e organiche basate su coloranti che etichettano i singoli componenti della retina, tra cui RGC, cellule amacrine, microglia e vascolarizzazione, sono compatibili con questa tecnica di imaging e consentono l’osservazione in vivo di tipi e strutture cellulari critiche per la funzione retinica. Questi strumenti possono essere adattati per etichettare la maggior parte degli altri tipi di cellule neuronali e le componenti gliali e vascolari della retina.

Protocol

NOTA: La seguente procedura è stata eseguita in conformità con le linee guida dell’Institutional Animal Care and Use Committee della Washington University di St. Louis. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti, le attrezzature e gli animali utilizzati in questo studio. 1. Iniezione di virus adeno-associati NOTA: L’etichettatura di cellule specifiche nella retina può essere eseguita in linee di topi transgenici Cre con modelli di espressione ristretti. Questa sezione descrive il rilascio intravitreale di vettori AAV che codificano l’espressione Cre-dipendente di una proteina fluorescente, marcando così specifiche cellule retiniche. Iniettare topi (maschi e femmine), a partire dalle 4 settimane di età. Preparazione dell’ago per micropipetteUtilizzare un estrattore di micropipette per creare un ago capillare in vetro borosilicato. Caricare un capillare di vetro nell’estrattore di micropipette ed eseguire il Ramp Test, registrando il valore risultante. Scartare il capillare di vetro utilizzato per il Ramp Test. Tirare micropipette con le seguenti impostazioni: calore: valore Ramp Test meno 10; tirare: 55; velocità: 65; tempo: 120; pressione dell’aria: 500; Tempo d’aria all’inizio del tiro: 20.Nota Potrebbe essere necessario regolare le impostazioni per diversi estrattori. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una lama di rasoio per tagliare la punta della micropipetta tirata nel punto in cui la punta di vetro devia leggermente sotto forza, ~ 10 mm dall’estremità della sezione conica. Tagliare con un angolo acuto in modo tale che il taglio produca una punta smussata. Scartare le punte smussate. Preparazione della siringa per iniezioneInserire una micropipetta di vetro tagliato in un segmento di 2 cm di tubo di plastica di etilvinil acetato (EVA) (diametro interno 0,05″, diametro esterno 0,09″). Collegare l’altra estremità di questo segmento di tubo a una lunghezza di 20 cm di tubo EVA (diametro interno 0,02″, diametro esterno 0,06″). Collegare il tubo a una siringa di vetro da 50 μL con un ago cementato da 22 G. Rimuovere lo stantuffo dalla siringa di vetro e riempire la siringa e il tubo collegato con olio minerale utilizzando un ago da siringa da 25 G. Lasciare uno spazio d’aria di 4 mm sulla punta della micropipetta. Iniezione intravitreale di AAVEseguire l’iniezione intravitreale con tecnica asettica standard, utilizzando guanti chirurgici sterili, camice da laboratorio pulito, maschera, campo sterile e strumenti autoclavati secondo i protocolli istituzionali per la chirurgia di sopravvivenza. Rimuovere un’aliquota del vettore AAV dal deposito a -80 °C e scongelare sul ghiaccio. Dopo lo scongelamento, centrifugare per 10 s a 2.000 × g per rimuovere eventuali bolle d’aria. Seguire le linee guida per l’anestesia e le sostanze controllate del Comitato istituzionale per gli studi sugli animali. Utilizzando un ago ipodermico da 30 G, eseguire un’iniezione intraperitoneale (IP) di 0,1 ml/10 g di peso corporeo di un cocktail ketamina/xilazina (10 mg/mL di ketamina, 1 mg/mL di xilazina in soluzione salina, dose efficace al topo: 100 mg/kg di ketamina, 10 mg/kg di xilazina). Riportare il mouse nella sua gabbia e lasciare 5 minuti affinché l’anestesia abbia effetto. Utilizzando un ago ipodermico da 30 G, eseguire un’iniezione sottocutanea di meloxicam (0,5 mg/ml in cloruro di sodio allo 0,9%). Testare la profondità dell’anestesia confermando la perdita del riflesso corneale e del riflesso di ritiro alla coda e al pizzico della coda e della punta. Se il riflesso corneale persiste dopo la perdita del riflesso di ritiro della coda e delle dita dei piedi, applicare una goccia di soluzione di proparacaina allo 0,5% su ciascun occhio e attendere 10 secondi. Posizionare il mouse su un lato sotto lo stereomicroscopio. Usa un mini morsetto emostatico bulldog per afferrare la pelle superiore e inferiore all’orbita e fissa il morsetto al canto mediale per spostare parzialmente il globo fuori dall’orbita. Forare la sclera laterale con la micropipetta tagliata collegata alla siringa di vetro, ~1-2 mm posteriormente al limbus. Evitare di disturbare la vascolarizzazione che corre circonferenzialmente immediatamente posteriore al limbus. Eseguire la puntura con un angolo perpendicolare alla sclera e ritrarre leggermente la micropipetta immediatamente dopo aver perforato la sclera per evitare di danneggiare la lente. Utilizzare lo stantuffo della siringa di vetro per prelevare 1-2 μL di umore vitreo, corrispondente approssimativamente al volume del fluido destinato all’iniezione. Ritirare la micropipetta dall’occhio ed espellere l’umore vitreo rimosso. Riempire la punta della micropipetta con 1-2 μL di AAV, lasciando ~4 mm di spazio d’aria tra il vettore virale e l’olio minerale per evitare la miscelazione. Inserire la micropipetta nel foro nella sclera creato dalla prima puntura e premere lentamente lo stantuffo della siringa di vetro per iniettare il vettore virale nel corso di 20-30 s. Visualizzare il livello del fluido del vettore virale nella punta della micropipetta e fare attenzione a interrompere l’iniezione prima che l’aria entri nell’occhio. Tenere la micropipetta nella stessa posizione per 10 secondi, quindi ritrarre la micropipetta. Rimuovere il morsetto emostatico del bulldog. Applicare ossitetraciclina / polimixina B antibiotico unguento oftalmico all’occhio iniettato. Posizionare il mouse su un termoforo e monitorarne il recupero dall’anestesia (vedere 3.4.3). Riportare il topo al suo alloggiamento ed eseguire cure postoperatorie secondo le linee guida istituzionali. Attendere 2-3 settimane per l’espressione virale-mediata dei fluorofori prima dell’imaging. 2. Configurazione del microscopio NOTA: Uno schema del percorso della luce del microscopio è mostrato nella Figura 1. Apparecchiature “Always-On”: questi strumenti devono rimanere sempre accesi a meno che non siano sottoposti a regolazione o manutenzione. Impostare l’alta temperatura del sistema di raffreddamento laser su 20,0 °C. Accendere l’alimentazione principale del laser ultraveloce Ti:Sapphire, attendere il completamento dei processi di avvio del sistema e ruotare il tasto “Laser Enable” sulla posizione “On”. Configurazione del percorso della luce di emissioneConfigurare il percorso di raccolta delle emissioni di fluorescenza per le lunghezze d’onda del campione utilizzando set di filtri dicroici e passa-banda appropriati per i fluorofori di interesse.NOTA: In questo manoscritto, l’imaging di Twitch2b ha utilizzato un cubo filtro costituito da coppie di filtri dicroici a passaggio lungo 505 e 480/40 e 535/30. La GFP è stata ripresa utilizzando un cubo di filtro rosso/verde costituito da un filtro passa lungo 560 con filtri passa-banda 525/50 e 605/70. Evans Blue è stato ripreso utilizzando un filtro a passaggio corto 560. La sostituzione dei filtri di emissione espone il percorso della luce di emissione alla luce diffusa della stanza che potrebbe danneggiare i tubi fotomoltiplicatori (PMT). Assicurarsi che i PMT siano spenti e spegnere le luci della stanza prima di modificare il percorso della luce di raccolta poiché l’esposizione alla luce può influire negativamente sulla funzione PMT. Avvio dell’acquisizione di immaginiNOTA: L’esposizione diretta al laser a due fotoni è pericolosa, specialmente per l’occhio poiché la luce rossa lontana non induce una risposta lampeggiante. È necessario prestare la dovuta attenzione per garantire che il laser sia chiuso lungo il percorso della luce e che siano presenti delle misure di sicurezza per proteggere l’utente dall’esposizione attraverso gli oculari o dalle emissioni dell’obiettivo del microscopio. Gli utenti dovrebbero capire in quali condizioni il laser emetterà dall’obiettivo e prendere le dovute precauzioni per non esporsi a tali pericoli.Accendere il dispositivo di acquisizione dati, il computer, la cella Pockels, il microscopio e il controller di scena, il controller dell’otturatore meccanico e l’alimentazione principale PMT. Mantenere i PMT nello stato “Disabilitato” fino a quando non sono pronti per l’acquisizione delle immagini e schermati dalla luce diffusa. Aprire l’interfaccia di controllo laser sul computer e il software di acquisizione delle immagini. Accendere il laser dall’interfaccia del computer e assicurarsi che la modalità di blocco. Impostare la lunghezza d’onda laser desiderata. Assicurarsi che la luce laser entri nella cella Pockels aprendo l’otturatore laser e attendere 30 minuti per la stabilizzazione della potenza laser. Misurazione della potenza laser all’obiettivo e impostazione della percentuale massima di laserNOTA: la radiazione laser emette dalla lente dell’obiettivo durante la misurazione della potenza. Chiudere la tenda dell’involucro del microscopio e indossare un’adeguata protezione per gli occhi prima di attivare l’otturatore di imaging. Misurare la potenza del laser al momento dell’installazione iniziale del sistema per stabilire la curva di potenza di uscita per ciascuna lunghezza d’onda di interesse e successivamente mensilmente per verificare la stabilità della potenza di eccitazione.Accendere il misuratore di potenza ottica e selezionare la lunghezza d’onda di misurazione corrispondente alla lunghezza d’onda del laser. Posizionare il rilevatore del misuratore di potenza ottica sul palco del microscopio e manovrarlo direttamente sotto la lente dell’obiettivo nelle dimensioni X-Y. Utilizzando l’azionamento motorizzato di messa a fuoco di dimensione Z, abbassare l’obiettivo fino a quando il rilevatore del misuratore di potenza non si trova ~ 1 mm sotto l’obiettivo. Passare dall’illuminazione a epifluorescenza al laser come percorso della luce di eccitazione del microscopio. Attivare l’otturatore meccanico. Nel software di acquisizione delle immagini, avviare una scansione puntuale per aprire l’otturatore di imaging e inviare il laser al misuratore di potenza ottica. Impostare la potenza del laser al 100% nel software di scansione. Ottimizzare le posizioni X-Y e Z del rilevatore del misuratore di potenza fino a ottenere la massima misurazione della potenza laser. Misurare la potenza del laser all’obiettivo dallo 0,1% al 100% sulla cella Pockels, effettuando misurazioni a intervalli del 10%. Registrare la percentuale della cella di Pockels corrispondente a 45 mW di potenza all’obiettivo. Impostare questa percentuale come potenza laser massima nel software di acquisizione delle immagini.NOTA: La potenza massima osservata per l’imaging retinico del topo in vivo senza danni visibili al tessuto bersaglio è stata di 45 mW, come testato mediante colorazione istologica due settimane dopo l’imaging. Un evidente danno retinico è evidente dopo l’imaging con 55 mW all’obiettivo. Disattivare l’otturatore di imaging e riportare il percorso della luce di eccitazione all’epifluorescenza. 3. Preparazione del mouse per l’acquisizione di immagini Anestetizzante del mouse per l’imagingNOTA: Garantire un’adeguata depurazione dei gas di scarico per mitigare l’esposizione all’isoflurano. Assicurarsi che la porta di scarico della camera di induzione per anestesia sia collegata a un contenitore del filtro del gas di evacuazione passivo e che l’uscita del nasello per anestesia del topo sia collegata a un cannister del filtro del gas di evacuazione attivo con vuoto fornito da un apparato di evacuazione del gas. Seguire le linee guida del produttore per monitorare il peso del contenitore del filtro per la sostituzione.Anestetizzare il topo usando il cocktail ketamina/xilazina come descritto sopra al punto 1.3.3. In alternativa, indurre l’anestesia tramite inalazione di isoflurano se si utilizza anche isoflurano per il mantenimento dell’anestesia (sessione di imaging > 30 minuti). Impostare il dispositivo di anestesia per piccoli animali per riempire la camera di induzione con isoflurano al 5% miscelato con aria ambiente ad una portata di 0,5 L/min. Posizionare il mouse nella camera di induzione e lasciare 15 s affinché il topo venga anestetizzato. Impostare il vaporizzatore isoflurano allo 0% e dirigere il flusso dell’anestesia verso il nasello. Eseguire un “lavaggio O2 ” di 5 secondi della camera di induzione. Estrarre il mouse dalla camera a induzione e fissarlo nel supporto della testa (vedere paragrafo 3.3), fissando il nasello. Utilizzare una miscela di isoflurano all’1% con aria ambiente ad una portata di 0,5 L/min per il mantenimento dell’anestesia. Monitorare la frequenza respiratoria a intervalli di 5 minuti durante l’anestesia, regolando la percentuale di isoflurano per mantenere una frequenza respiratoria di ~60 respiri / min.NOTA: Queste impostazioni (% isoflurano, portata) possono essere utilizzate anche per il mantenimento dell’anestesia indotta dal cocktail ketamina/xilazina. Dilatazione della pupillaPreparare una soluzione di atropina all’1% p/v e 2,5% p/v di fenilefrina cloridrato in acqua. Conservare la soluzione dilatatrice a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Utilizzando un contagocce monouso per pipette, applicare una goccia della soluzione dilatatrice a ciascun occhio che verrà ripreso. Spegni le luci della stanza e attendi 5 minuti che la pupilla si dilati. Quando la pupilla è dilatata, asciugare la soluzione dilatatrice con tessuto privo di lanugine.NOTA: Assicurarsi che la soluzione dilatatrice non penetri nelle narici. Applicare una grande goccia di gel contorno occhi lubrificante su ciascun occhio che verrà ripreso. Se entrambi gli occhi devono essere ripresi, applicare un piccolo pezzo di pellicola trasparente di plastica sul gel per gli occhi sull’occhio non imaging per prevenire la disidratazione. Se si esegue l’imaging di un solo occhio, applicare un unguento per gli occhi lubrificante sull’occhio che non verrà ripreso. Mouse di posizionamento per l’imagingPer fissare il mouse nel supporto della testina di imaging, ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a inclinare la barra dell’auricolare con un angolo di 60° o più al di sotto dell’orizzontale. Fissare il perno del condotto uditivo inferiore nella posizione estesa verso l’interno e il perno del condotto uditivo superiore nella posizione ritirata. Con il mouse rivolto verso la barra del morso, montare un orecchio sul perno inferiore esteso, inserendo il perno nel condotto uditivo. Allentare la vite che fissa il perno del condotto uditivo superiore ed estendere il perno nell’altro condotto uditivo. Stringere la vite per fissare la testa. Fai scorrere la barra del morso verso la testa del mouse. Sollevare delicatamente la testa del topo, quindi abbassare gli incisivi mascellari del mouse nel foro della barra del morso. Ritrarre la barra del morso con forza delicata per fissare la testa del mouse e fissare la posizione della barra del morso serrando la vite. Se si utilizza l’isoflurano, far scorrere il nasello attraverso la sua fessura sulla barra del morso prima di fissare gli incisivi del mouse. Fissare e stringere la posizione della barra del morso come al punto 3.3.3. Stringere il nasello usando le due viti sulla faccia superiore fino a quando non si adatta perfettamente al naso del mouse, ma non restringe il muso. Trasferire il mouse, nel supporto della testa, allo stadio del microscopio sotto l’obiettivo. Ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la pupilla dell’occhio è orientata verso l’alto, in linea con il percorso della luce (Figura 2). Posizionare un coprislip #1.5 nel portafiltro compatto e collegare il supporto allo stadio del microscopio. Abbassare il coprislip verso l’occhio, contattando il gel lubrificante per gli occhi, in modo che il coprislip si trovi orizzontalmente immediatamente sopra la cornea (Figura 2). Assicurarsi che il coprislip non tocchi la cornea.NOTA: Sul microscopio, assicurarsi che il percorso della luce di eccitazione sia impostato su epifluorescenza e che il percorso della luce di emissione sia impostato sull’oculare. Accendere l’illuminatore a epifluorescenza alla sua potenza più bassa e aprire l’otturatore dell’illuminatore. Scegliere la lunghezza d’onda dell’illuminatore di epifluorescenza e il filtro di fluorescenza corrispondenti al fluoroforo da riprendere. Manovra lo stadio nelle dimensioni X-Y e l’obiettivo nella posizione Z utilizzando il controllo dello stage e l’azionamento motorizzato della messa a fuoco fino a quando la luce di eccitazione a campo ampio copre completamente la cornea. Guardando attraverso l’oculare, continuare a regolare la posizione Z dello stadio fino a quando le cellule fluorescenti o le strutture della retina non vengono messe a fuoco. Aumentare la potenza dell’illuminatore a epifluorescenza se il segnale del campione non è sufficientemente luminoso da risolvere singole cellule o strutture di interesse attraverso l’oculare.NOTA: in caso di problemi di localizzazione della retina, l’iride è un punto di riferimento ad alto contrasto su cui ancorarsi e quindi concentrarsi verso il basso verso la retina. Questo passaggio consentirà anche di verificare che la pupilla sia dilatata al massimo. Ottenere un’area di imaging sull’asse con l’obiettivo del mouse. Regolare l’angolazione del mouse utilizzando i vari gradi di libertà sul supporto della testa fino a quando non si verifica solo l’espansione o la contrazione della luce sfocata quando si regola il piano focale. Spegnere l’illuminatore a epifluorescenza e chiudere l’otturatore dell’illuminatore.NOTA: una significativa parallasse X-Y della luce fuori fuoco durante lo scorrimento dei piani focali della direzione Z indica che la retina non è in asse rispetto al percorso della luce di imaging. 4. Acquisizione di immagini a due fotoni Impostazione dell’immagine e parametri di acquisizioneNOTA: spegnere le luci della stanza e coprire le fonti di luce diffusa nella stanza. Assicurarsi che l’illuminatore a epifluorescenza sia spento e che l’otturatore dell’illuminatore sia chiuso.Passare il percorso della luce di eccitazione al laser e il percorso della luce di emissione ai PMT. Nel software di acquisizione immagini, impostare una dimensione del fotogramma di 512 x 512 e una media fotogrammi di 3. Impostare i passi per fetta su -8 μm. Designare lo z-stepping per iniziare dalla parte superiore della pila e progredire verso il basso, riducendo al minimo l’attivazione laser a due fotoni dei fotorecettori.NOTA: la dimensione del passo può essere ridotta per aumentare la risoluzione Z al costo di un aumento del tempo di imaging, ma gli incrementi di 8 μm sono sufficienti per risolvere i somati cellulari in questa configurazione di imaging. Accendere e abilitare i PMT. Regolare la tensione PMT a 680 V. Attivare l’otturatore di eccitazione.NOTA: i PMT alimentati sono suscettibili di danni leggeri. Assicurarsi che l’illuminatore a epifluorescenza sia spento, che la tenda del microscopio sia disegnata e che le luci della stanza siano spente. Inizia un’anteprima dell’immagine dal vivo del tessuto target, iniziando con una potenza laser dell’1%. Regolazione automatica della luminosità del display per visualizzare le celle o le strutture di interesse. Regolazione automatica della fase di scansione. Se il tessuto bersaglio è debole o poco chiaro, aumentare la percentuale di potenza del laser fino a quando le strutture diventano visibili senza superare il limite fissato al punto 2.4.4 corrispondente a 45 mW.NOTA: per un’immagine a 16 bit, un valore di visualizzazione di ~1000 quando si regola automaticamente la luminosità in un piano Z contenente strutture di interesse indica una luminosità sufficiente del campione. Manovra lo stadio del microscopio nella direzione X-Y per centrare un’area di imaging desiderata, quindi naviga verso il piano Z con le strutture di interesse a fuoco.NOTA: L’imaging adiacente alla testa del nervo ottico consente di fungere da punto di riferimento inequivocabile per gli esperimenti di imaging cronico. Se si tratta di un esperimento time-lapse cronico, aprire un’immagine precedente sul computer di acquisizione e utilizzarla come riferimento per trovare la stessa area di interesse. Assicurarsi che l’angolo di imaging sia simile a quello delle immagini precedenti per acquisire lo stesso set di celle con parallasse minima.NOTA: è probabile che sia necessaria un’ulteriore regolazione della posizione della testa del mouse per visualizzare le stesse celle dei punti temporali precedenti (Figura 3). Impostare i limiti Z dello stack di immagini passando ai piani Z più in alto e più in basso di interesse e acquisire l’immagine. Al termine dell’acquisizione dell’immagine, disattivare i PMT e l’otturatore di emissione. Riportare il percorso della luce di emissione all’oculare e il percorso della luce di eccitazione all’illuminazione dell’epifluorescenza. Rimuovere il mouse dalla fase del microscopio. Arresto del software e dell’hardware di sistemaUscire dal software di acquisizione immagini. Spegnere il laser nell’interfaccia del computer. Spegnere l’hardware in ordine di avvio inverso, ad eccezione dell’apparecchiatura “Always-On”. Recupero del mouseRimuovere il supporto della testa e il mouse dallo stadio del microscopio. Se applicabile, impostare il vaporizzatore isoflurano su 0%. Rimuovere il mouse dal supporto della testa. Pulire delicatamente il gel contorno occhi lubrificante con un tessuto privo di lanugine e applicare un unguento per gli occhi lubrificante con olio minerale di petrolato bianco su entrambi gli occhi. Posizionare il topo sulla piastra riscaldante a circolazione di acqua calda (impostata a 37 °C), continuare ad assistere il topo e monitorarne la frequenza respiratoria fino a quando il topo non si sveglia e riacquista la capacità ambulatoriale. Riportare il mouse nel suo alloggiamento. Se applicabile, valutare l’attività e la morbilità degli animali a 24 ore dopo l’iniezione intravitreale. Al termine dello studio, eutanasia il topo con un sovradosaggio di tribromoetanolo (250 mg / kg) ed eseguire la perfusione transcardica con paraformaldeide al 4% per preservare il tessuto retinico. 5. Elaborazione e analisi delle immagini Deinterleave e unione di dati multicanalePoiché alcuni programmi software di acquisizione immagini memorizzano immagini multicanale in un formato interleaved, aprire il file di immagine .tif utilizzando software, come Fiji (https://imagej.net/Fiji), per separare i canali. Nel menu Immagine delle Figi, seleziona Pile | Strumenti | Deinterleave. Immettere il numero di canali che compongono l’immagine e fare clic su OK. Per unire i canali separati in un unico file, vai a Immagine | Colore | Unisci canali. Posizionate i canali immagine deinterlacciati in canali di colore separati e fate clic su OK per creare l’immagine composita multicanale. Salvare l’immagine composita come nuovo file .tif. Quantificazione dell’intensità di fluorescenza in immagini multicanaleNOTA: L’intensità della fluorescenza all’interno di regioni di interesse designate (ROI) può essere quantificata in piani a immagine singola utilizzando Fiji. La quantificazione delle letture raziometriche può essere ottenuta misurando l’intensità della fluorescenza in diversi canali di un’immagine composita all’interno dello stesso ROI. Per gli esperimenti di imaging cronico, è meglio utilizzare biosensori basati su uscite di eccitazione o rapporto di emissione.Nelle Figi, vai su Analisi | Strumenti | Responsabile ROI. Apri l’immagine composita nelle Figi. Scorri fino alla z-slice corrispondente alla struttura di interesse e utilizza gli strumenti di selezione (come selezione rettangolare, selezione ovale, selezione poligono) per delineare i ROI. Premere T sulla tastiera per aggiungere ogni selezione a ROI Manager. Al termine della selezione del ROI, fare clic su Misura in Gestione ROI per registrare vari dati dai ROI come il valore dell’area e dell’intensità media. Copiare le misurazioni per il canale attualmente selezionato registrate nella finestra Risultati in un foglio di calcolo. Passare al canale successivo nella finestra Immagine composita e fare clic su Misura per ottenere misurazioni per quel canale all’interno dello stesso set di ROI. All’interno del ROI Manager, vai a Altro | Salva e salva i ROI come file .zip. Proiezioni di massima intensità per il displayPer creare visualizzazioni dei dati dell’immagine, utilizzare la funzione Z-project nelle Figi. Nel menu Immagine , selezionare Pila | Progetto Z. Scegli solo le cornici all’interno delle quali sono presenti le aree di interesse per ridurre lo sfondo. Se si desidera rimuovere il rumore di ripresa PMT, utilizzare la funzione di filtro Mediana. Nel menu Processo , selezionare Elabora | Filtri | Mediana. Scegliete un valore pari a 1,0 per mantenere i dettagli spaziali. Per creare proiezioni di massima intensità focalizzate su singole celle, ripetere questo processo scegliendo solo i fotogrammi dell’immagine che corrispondono alla cella di interesse.NOTA: Questo può migliorare notevolmente la capacità di risolvere i pergole cellulari (Figura 4). Le misurazioni dell’intensità di fluorescenza devono essere eseguite su piani a immagine singola e non su proiezioni di intensità massima.

Representative Results

Vari approcci transgenici, vettoriali virali o di marcatura inorganica possono essere utilizzati per visualizzare specificamente diversi tipi e strutture di cellule retiniche in vivo utilizzando un semplice adattamento di un microscopio multifotone di base. Per visualizzare RGC e cellule amacrine, i topi transgenici VGlut2-Cre e VGat-Cre, rispettivamente, hanno ricevuto un’iniezione intravitreale di un costrutto di espressione AAV Cre-dipendente che codifica Twitch2b, un sensore Ca 2+ basato su Ca 2+ di risonanza di fluorescenza citoplasmatica (FRET) che contiene proteine fluorescenti ciano e gialle (CFP e YFP, rispettivamente) e il dominio di legame Ca2+ della troponina15. . Nei topi VGlut2-Cre, i somi RGC sono chiaramente distinguibili e i fascicoli degli assoni sono spesso evidenti (Figura 3). Va notato che la traiettoria degli assoni e l’immagine negativa della vascolarizzazione rendono molto semplice identificare la testa del nervo ottico nei topi VGlut2-Cre, che è utile come punto di riferimento negli esperimenti di imaging cronico (Figura 3). Sebbene le cellule amacrine appaiano meno luminose delle RGC, probabilmente a causa della loro dimensione più piccola del soma e/o della trasduzione AAV meno efficiente, i loro somi sono ancora facilmente evidenti nello strato nucleare interno. A differenza delle RGC, i neuriti delle cellule amacrine sono più spesso osservati negli strati plessiformi interni (Figura 4). La microglia retinica può essere ripresanella linea 6 del topo transgenico Cx3cr1-GFP. La microglia si associa alla vascolarizzazione, rendendo possibile trovare la stessa regione negli esperimenti di imaging time-lapse. Questo approccio può essere utilizzato per tracciare la dinamica dei processi di microglia fine, una procedura che ha una migliore risoluzione spaziale nelle immagini a piano singolo, o se vengono preparate proiezioni di massima intensità concentrandosi sulle singole cellule (Figura 5). La scarsa risoluzione assiale causata dall’aberrazione ottica attraverso la lente del mouse preclude l’esame di dettagli fini nella dimensione z. Per determinare se questa tecnica di imaging può osservare cambiamenti degenerativi nell’ultrastruttura cellulare, 1 μL di 50 mM N-metil-D-aspartato (NMDA) è stato iniettato nel vitreo per indurre una lesione eccitotossica. Un giorno dopo l’iniezione, la microglia ha mostrato processi brevi o morfologia ameboide (Figura 5) in conformità con i rapporti precedenti16. Va notato che le cellule della linea transgenica Cx3cr1-GFP hanno mostrato un’espressione proteica fluorescente più uniforme e completa in tutta la coorte cellulare rispetto agli esperimenti con somministrazione mediata da AAV di cassette di espressione proteica fluorescente. I vantaggi di un’etichettatura varia e sparsa rispetto a un’etichettatura completa e uniforme dovrebbero essere considerati quando si progettano esperimenti. Per marcare la vascolarizzazione retinica come descritto in precedenza8, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 200 μL di colorante blu di Evans (20 mg / ml in soluzione salina sterile) 30-60 minuti prima dell’imaging. Ciò ha portato a una forte etichettatura dei vasi sanguigni provenienti dalla testa del nervo ottico (Figura 6). Sorprendentemente, il segnale fluorescente di una singola iniezione è persistito per almeno sette giorni. Sono stati utilizzati due metodi distinti per stimare le dimensioni delle immagini in vivo. In primo luogo, le stesse regioni retiniche sono state visualizzate in vivo e dopo la fissazione in interi retinici appiattiti utilizzando la microscopia confocale (Figura 7). Sono state selezionate coppie di cellule casuali da quattro diversi campioni in vivo e la vera distanza tra le coppie di cellule è stata misurata in scansioni confocali e abbinata alla distanza dei pixel in vivo per ottenere una dimensione media dei pixel di 0,99 μm con ingrandimento digitale 1x. Utilizzando metodi simili correlando le immagini in vivo con le scansioni confocali wholemount ha rivelato che una singola posizione della testa consente di visualizzare immagini su una patch di retina di circa 650 mm2 . Il riposizionamento del supporto della testa lungo un asse torsionale può consentire l’accesso a una regione lineare della retina di 2,2 mm di lunghezza (non mostrata). Inoltre, microsfere fluorescenti di 1 o 2 μm di diametro sono state iniettate negli occhi dei topi e il loro diametro è stato misurato come metà larghezza completa delle scansioni di linea da immagini in vivo con zoom digitale 10x. Ciò ha fornito una stima delle dimensioni dei pixel leggermente più grande, ma con una maggiore varianza (Figura 7). Nel complesso, l’imaging confocale di campioni interi dopo il completamento degli esperimenti in vivo è il metodo più coerente per assegnare la scala alle singole immagini, poiché la varianza nelle proprietà corneali e del cristallino può alterare la scala dell’immagine da campione a campione. Figura 1: Schema del percorso luminoso. I componenti di base del microscopio a due fotoni utilizzati in questo protocollo consistono in una cella di Pockels per modulare la potenza del laser, una coppia di lenti per ridurre il diametro del raggio laser per abbinare l’apertura posteriore dell’obiettivo del microscopio e una coppia di specchi a scansione galvo per la direzione del fascio. Una coppia di specchietti retrovisori dello sterzo è presente prima di ogni componente ottico principale. La messa a fuoco è controllata da un motore che aziona il supporto dell’obiettivo. Il percorso della luce di emissione può essere personalizzato per diversi fluorofori sostituendo i filtri dicroici e barriera. Viene visualizzata una configurazione generale per l’imaging ciano/giallo/rosso in cui uno specchio dicroico a passaggio corto dirige la luce rossa al primo PMT e uno specchio dicroico a passaggio lungo abbinato a filtri passa-banda appropriati viene utilizzato per separare le emissioni ciano e gialle. Abbreviazione: PMT = tubo fotomoltiplicatore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Posizionamento dei topi per l’imaging in vivo. Per posizionare il mouse con la pupilla sull’asse con il percorso della luce, il topo anestetizzato viene prima trattenuto in un supporto per la testa, la testa viene ruotata e angolata, una grande goccia di gel per gli occhi lubrificante viene posizionata sull’occhio e il mouse viene posizionato sul palco. Un coprislip è montato nel supporto del coprislip perpendicolare al percorso della luce e abbassato verso l’occhio. Il coprislip non deve entrare in contatto con la cornea o la testa del topo (a sinistra), il che sarà evidente se il coprislip viene deviato. Tuttavia, il foglietto di copertura dovrebbe anche essere abbastanza vicino da evitare la perdita della goccia (a destra), perché ciò avrà un effetto demagnificante sul campione. Dopo aver applicato l’immersione in gel e fissato il vetrino, il palco deve essere spostato in posizione direttamente sotto l’obiettivo del microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Imaging delle cellule gangliari retiniche. Per la visualizzazione delle immagini, vengono create proiezioni di massima intensità con i piani z contenenti celle di interesse e le immagini risultanti vengono filtrate medianamente per rimuovere il rumore di ripresa PMT. Vengono mostrati due esempi di cellule gangliari retiniche marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGlut2-Cre, in particolare il segnale CFP. Le immagini sono state acquisite durante le sessioni a quattro giorni di distanza l’una dall’altra e sono stati utilizzati punti di riferimento vascolari per tornare nella stessa regione vicino alla testa del nervo ottico. La testa del nervo ottico è orientata verso la parte inferiore dell’immagine. Sebbene entrambi i campioni mostrino una certa varianza nell’orientamento (le regioni con intensità ridotta sono indicate con frecce), la maggior parte delle celle è presente in entrambi i punti temporali. Barra di scala = circa 50 μm. Abbreviazioni: PMT = tubo fotomoltiplicatore; AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGlut2 = trasportatore vescicolare del glutammato 2; CFP = proteina fluorescente ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Imaging delle cellule amacrine. Le cellule di amacrine sono state marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGat-Cre. Il segnale CFP di Twitch 2b è specificamente mostrato. Piccole proiezioni di intensità massima focalizzate sulle profondità dello strato nucleare interno indicano somi a cellule amacrine, mentre concentrandosi sul plessiforme interno si risolvono i neuriti delle cellule amacrine (freccia). La testa del nervo ottico è orientata verso destra dell’immagine. Barra di scala = circa 50 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGat = trasportatore vescicolare dell’acido gamma aminobutirrico; CFP = proteina fluorescente ciano; INL = strato nucleare interno; IPL = strato plessiforme interno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Imaging delle microglia. La linea di topi transgenici Cx3cr1-GFP è stata utilizzata per marcare le microglia. Una proiezione di massima intensità dell’intero volume di scansione mostra molte microglia, alcune con dettagli di processo fini che possono essere risolti. Si noti che le celle verso la parte inferiore sinistra del campo hanno meno distorsione nella proiezione massima rispetto a quelle verso l’alto a destra a causa della parallasse in questa regione. Le proiezioni di intensità massima contenenti solo la cella di interesse riducono significativamente questa parallasse (al centro, inscatolata nei colori corrispondenti). Inoltre, questa strategia di imaging può documentare la dinamica del rimodellamento del processo di microglia fine (pannelli inferiori). Comparativamente, molte microglia possono essere osservate con processi brevi o morfologia ameboide un giorno dopo una lesione eccitotossica mediante iniezione intravitreale di 50 mM NMDA (a destra). Barra di scala = circa 50 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; Cx3cr1 = recettore 1 delle chemochine Cx3; NMDA = N-metil-D-aspartato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 6: Etichettatura dei punti di riferimento vascolari. Ai topi sono stati iniettati 200 μL di 20 mg/mL di blu di Evans per via intraperitoneale 30-60 minuti prima della prima sessione di imaging. Le proiezioni di intensità massima a tutto spessore dimostrano una fluorescenza duratura nel sistema colarizzatore retinico che persiste per almeno sette giorni. Barra di scala = circa 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Dimensioni dell’immagine. Le cellule gangliari retiniche marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGlut2-Cre sono state visualizzate in vivo e la stessa regione è stata quindi ripresa mediante microscopia a scansione laser confocale dopo la fissazione e la preparazione completa della retina. Il canale proteico fluorescente giallo è mostrato per entrambi. Le coppie di frecce colorate indicano la stessa cella in entrambi i preparati (pannelli superiori). Immagine a piano singolo di microsfere fluorescenti di 2 μm di diametro iniettate per via intravitreale e riprese in vivo (pannello in basso a sinistra). Le microsfere non si depositavano e quindi erano in costante movimento rendendo impossibile la misurazione della risoluzione assiale. Dimensioni dei pixel calcolate da misurazioni a mezza larghezza massima di microsfere fluorescenti in vivo o misurazioni confocali correlate prese da 2-4 retine per gruppo (in basso a destra). Barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGlut2 = trasportatore vescicolare del glutammato 2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 8: Attività del calcio indotta dalla scansione a due fotoni. Cellule gangliari retiniche marcate iniettando AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b in topi transgenici VGlut2-Cre, YFP è pseudocolorato magenta e verde CFP, ripreso in un singolo piano come serie temporale a 4,22 Hz. Tutti gli RGC avevano un rapporto YFP/CFP iniziale simile. La maggior parte ha risposto con un aumento del rapporto FRET (esclusa la cella arancione) e uno ha mantenuto un elevato rapporto YFP / CFP durante le serie temporali (cella gialla). I rapporti YFP/CFP sono stati normalizzati alla media del primo fotogramma e i cerchi colorati corrispondono alle tracce colorate. Gli asterischi indicano punti temporali con immagini rappresentative visualizzate a sinistra. Barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; EF1α = fattore di allungamento-1alfa; FLEX = flip-escissione; VGlut2 = trasportatore vescicolare del glutammato 2; YFP = proteina fluorescente gialla; CFP = proteina fluorescente ciano; RGC = cellule gangliari retiniche; FRET = trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

La procedura di imaging a due fotoni qui descritta consente l’imaging longitudinale in vivo della retina del topo. Immagini ripetibili della stessa regione della retina possono essere ottenute per un periodo continuo fino a 6 o più ore sotto isoflurano. Il mouse può anche essere ripreso in giorni diversi utilizzando punti di riferimento cellulari e vascolari per localizzare la stessa area di imaging (Figura 3). L’uso di un’immersione in gel trasparente combinata con vetro di copertura per questo scopo è stato precedentemente applicato a una serie di procedure, tra cui la visualizzazione della retina per l’iniezione sottoretinica, modelli di lesioni retiniche indotte dal laser e fundus imaging20,21,22.

L’anatomia dell’occhio presenta sfide uniche per l’imaging in vivo, poiché l’elevata potenza ottica della cornea e della lente del topo impedisce l’imaging diretto attraverso la pupilla senza correzione. Diversi altri metodi di imaging in vivo si basano sull’uso di una lente a contatto plano-concava per la correzione dell’ottica anteriore dell’occhio del topo 7,17,18,19. Con la sola correzione ottica della cornea, l’elevata potenza ottica della lente del topo si traduce in una quantità inevitabile di parallasse, in particolare di strutture nel campo di scansione periferica, che si manifesta come allungamento e movimento traslazionale nella dimensione X-Y a diversi piani Z. Per ridurre al minimo la distorsione correlata alla parallasse dell’immagine nelle dimensioni X e Y, è fondamentale che l’occhio del topo sia orientato in modo tale che il piano tangente alla retina nell’area di imaging sia perpendicolare al percorso della luce del microscopio. La configurazione qui descritta favorisce la manipolazione precisa dell’angolo dell’occhio per ottenere questo allineamento. Un supporto regolabile per la testa del mouse che consente la rotazione lungo due assi consente una facile regolazione manuale dell’angolo dell’occhio mentre lo sperimentatore scorre attraverso la dimensione Z per ridurre al minimo la parallasse. Questa inclinazione aggira anche l’effetto di arresto del campo della pupilla per consentire l’imaging di aree più grandi della retina. Il sistema di ritenuta del supporto della testa riduce notevolmente anche gli artefatti di movimento causati dalla respirazione.

È necessario prestare attenzione per mantenere la chiarezza dell’occhio del mouse, poiché la qualità dell’immagine si deteriorerà con l’opacizzazione durante l’imaging continuo. La frequente riapplicazione del gel lubrificante durante l’imaging e l’applicazione di unguento dopo ogni sessione di imaging aiutano a prevenire l’asciugatura dell’occhio e lo sviluppo di opacità. Alcune opacità corneali si risolveranno spontaneamente dopo 24-48 h. L’uso di gel trasparente e vetro di copertura come descritto in questo protocollo fornisce una qualità dell’immagine e una correzione dell’aberrazione simili a quelle di una lente a contatto7, consentendo al contempo una regolazione più semplice dell’angolo dell’occhio senza la necessità di riallineare il vetro di copertura. Inoltre, il gel fornisce un’idratazione continua all’occhio, rendendo possibile eseguire sessioni di imaging acute fino a diverse ore. Infine, poiché il vetro di copertura non entra in contatto con la cornea, provoca un’irritazione minima all’occhio che può ridurre la chiarezza ottica per ripetere le sessioni di imaging.

Un limite di questo approccio è il fatto che le aberrazioni ottiche non sono completamente corrette. Mentre questo diminuisce notevolmente la risoluzione assiale a causa della parallasse pesante, le misurazioni quantitative del soma possono essere ottenute in piani a immagine singola. Va notato che, poiché l’intensità del segnale di fluorescenza dei neuroni retinici dipende dall’allineamento del campione con questo metodo, i sensori basati sull’eccitazione e sul rapporto di emissione sono più appropriati per gli esperimenti che confrontano i campioni cronicamente in diverse sessioni di imaging. Un approccio per correggere le aberrazioni ottiche a livello di sistema è l’ottica adattiva, che consente la risoluzione subcellulare nella retina 8,9,14,21. Tuttavia, l’ottica adattiva richiede attrezzature altamente specializzate e una vasta esperienza da implementare.

Approcci alternativi all’imaging retinico in vivo a due fotoni sono la microscopia confocale o l’oftalmoscopia6. L’approccio qui presentato dovrebbe essere facilmente traducibile in microscopia a campo largo o confocale. L’imaging a singolo fotone è forse più robusto e presenta meno rischi di danneggiare la retina a causa dell’elevata energia del laser a due fotoni necessaria per ottenere un efficiente effetto a due fotoni attraverso la cornea e la lente dell’occhio. Per evitare danni laser a due fotoni, la soglia per la massima potenza laser dovrebbe essere determinata empiricamente esaminando le retine intere dopo il completamento degli esperimenti di imaging e l’immunocolorazione per i tipi di cellule negli strati ripresi. Nel sistema qui presentato, gli RGC sono stati etichettati con il marcatore pan-RGC, Rbpms, e le densità erano normali fino a 45 mW di potenza di imaging, mentre 55 mW hanno causato una significativa perdita di RGC (non mostrata).

Uno svantaggio dell’imaging a singolo fotone è il fatto che questo approccio stimolerà molto pesantemente i circuiti visivi nativi della retina rispetto all’imaging a due fotoni23. Precedenti esperimenti che utilizzano retinal wholemounts o preparazioni a coppa oculare hanno dimostrato che la scansione laser a due fotoni provoca l’attivazione del circuito che è in gran parte transitoria24. Qui, l’imaging dell’attività RGC con il sensore Ca 2+ Twitch2b mostra che l’inizio della scansione laser induce elevazioni di Ca 2+, che ritornano alla linea di base nel corso di5-20 s nella maggior parte degli RGC (Figura 8). Dato che la potenza del laser in questo protocollo è nell’intervallo di esperimenti precedenti che riportano la risposta alla luce retinica in vivo8, il metodo attualmente descritto è probabilmente suscettibile di registrazioni dell’attività del circuito nella retina. Tali considerazioni sono importanti per gli esperimenti che possono essere influenzati dall’attività del circuito.

Questo protocollo dimostra l’imaging in vivo di due tipi di neuroni retinici, RGC e cellule amacrine. È possibile ottenere una marcatura simile di altri tipi cellulari principali, tra cui cellule orizzontali (Cx57-Cre 25), cellule bipolari (Chx10-Cre 26; mGluR6-GFP 27), fotorecettori dei coni (S- o M-opsina-Cre 28), fotorecettori dei bastoncelli (Nrl-Cre 29), glia di Müller (Foxg1-Cre 26) e periciti (NG2-DsRed9). Topi transgenici sono disponibili anche per marcare sottoinsiemi discreti di RGC (ad esempio, KCNG4-Cre per αRGC30; OPN4-Cre per ipRGC31; JAM-B-CreER per J-RGCs 32) e cellule amacrine (ad esempio, ChAT-Cre per cellule amacrine starburst26 e driver promotori di neuropeptidi per vari sottotipi di cellule amacrine 3,34). I vettori virali possono essere utilizzati per colpire specifiche popolazioni cellulari al posto dei topi transgenici. Le iniezioni intravitreali di AAV2 con un elemento promotore CAG onnipresente etichettano quasi esclusivamente RGC, cellule amacrine e cellule orizzontali25. L’accoppiamento del capside AAV2.7m8-Y444F modificato con un costrutto promotore mGluR6 ingegnerizzato consente un’ampia etichettatura delle cellule bipolari ON35. Le iniezioni sottoretiniche di AAV portano ad un arricchimento dei fotorecettori, con il sierotipo AAV2/5 che ha la più alta efficienza di trasduzione36. Shh10, una proteina del capside AAV6 modificata, accoppiata con elementi promotori della proteina acida fibrillare gliale si è dimostrata specifica per la glia37 di Müller.

La capacità di osservare le cellule del sistema nervoso centrale con un approccio completamente non invasivo può essere utilizzata per studiare sia le proprietà di base dei circuiti neurali8, sia i meccanismi di neurodegenerazione 3,4,5,6,38. Molte malattie accecanti colpiscono le popolazioni cellulari nella retina e approcci di imaging in vivo nei topi sono stati utilizzati per studiare la lesione del nervo ottico 1,3,4, la degenerazione maculare13, l’ictus5, il glaucoma 2,6 e l’uveite7. Inoltre, molte condizioni neurodegenerative del sistema nervoso centrale si manifestano nella retina, tra cui il morbo di Alzheimer39, la sclerosi multipla40 e il morbo di Parkinson41. Pertanto, questa tecnica facilmente accessibile per l’imaging in vivo della retina può essere applicata come strumento per studiare una vasta gamma di condizioni neurodegenerative.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Research to Prevent Blindness Foundation (Career Development Award a P.R.W. e una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive presso la Washington University School of Medicine di St. Louis), National DrDeramus Research (un programma della BrightFocus Foundation) e il McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. è supportato da un Institutional National Research Service Award T32 EY013360. Questo lavoro è stato supportato anche dall’Hope Center Viral Vectors Core presso la Washington University School of Medicine.

Materials

#1.5 coverslip ThermoFisher 152440 Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL glass syringe Hamilton 80950 22G cemented needle
Adeno-associated virus (AAV2) Hope Center Viral Core NA
Anesthesia Air Pump RWD Life Science R510-30
Atropine Sigma A0132 For pupil dilator solution
Basic Small Animal Anesthesia Device RWD Life Science R500IE
Borosilicate glass capillary Sutter B150-86-10 Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm
CFP/YFP filter cube Chroma custom 480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex – Two channel PMT detection unit Scientifica S-MPLG-1002
Circulating heating pump Braintree Scientific tp-700 Set to 37 °C
Cling film VWR 10713-916
Compact Filter Holder ThorLabs DH1 Holds coverslip over mouse eye
Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) The Jackson Laboratory 005582
DAQ controller chassis National Instruments PXIe-1073
Data acquisition device National Instruments BNC-2090A
Evans Blue dye Fisher Scientific AAA1677409
FPGA module with digitizer National Instruments NI-5734
Gas Evacuation Apparatus RWD Life Science R546W
GenTeal Severe lubricant eye gel   Alcon (from local pharmacy) For use during imaging
GFP/Red filter cube Chroma custom 535/30, 560 long pass, 605/70
Heating pad McKesson Medical and Surgical 190147
HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell Scientifica S-MP-101080
HyperScope Main module Scientifica S-MP-100466
HyperScope Scan Path Scientifica S-MP-100406
HyperScope X galvo Module Scientifica MP-100443
ImageJ Fiji software Freeware
Isoflurane Patterson Veterinary NDC 14043-704-06
Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) RWD Life Science R510-31
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) RWD Life Science R510-31S
ketamine HCl (100 mg/mL) Vedco NDC 50989-161-06
M32 to M26 adapter ThorLabs M32M26S
MaiTai GUI software Spectra-Physics NA
MATLAB software MathWorks NA R2015b
meloxicam (5 mg/mL) Boehringer Ingelheim NDC 0010-6013-01 Analgesic
Micorscope Objective Edmund Optics 46-404 Mitutoyo WE715042319
micropipette puller Sutter Flaming/Brown Model P-97
Mineral oil Fisher BP2629-1
Mini bulldog hemostatic clamp Fine Science Tools 18053-28
Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD McMaster Carr 1883T1
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD McMaster Carr 1883T4
Mouse head holder Narishige SGM-4
No. 5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
Optic Posts 1/2" ThorLabs TR3-P5
Optical power meter kit ThorLabs PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery Scientifica COO-LED3ULLGs
Phenylephrine hydrochloride Sigma P6126 For pupil dilator solution
Pockels cell Conoptics 350-80-02
Pockels cell amplifier Conoptics Model 302RM
Proparacaine hydrochloride Sigma 1571001 For eye immobilization
Red & Far Red short pass filter Cube Chroma custom 560 short pass
Rotating 1/2" post clamp ThorLabs SWC
ScanImage package Vidrio Technologies Freeware Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB
sodium chloride solution, sterile (0.9%) Fresenius Kabi NDC 63323-186-01
Stereomicroscope Leica S9 E
Tabletop centrifuge Oxford Benchmate C8
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment Zoetisus NA For use after intravitreal injection
ThermoRack cooling system Solid State Cooling Systems ThermoRack 401 Set to 20 °C
Ultrafast Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016962
VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) The Jackson Laboratory 016963
VivoScope for In Vivo Imaging Scientifica S-MPVS-1200-00P
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment Stye NA For use after imaging
xylazine HCl (20 mg/mL) Akorn NDC 59399-110-20
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Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (168), e61970, doi:10.3791/61970 (2021).
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