体内成像是研究健康和疾病生物学的有力工具。该协议描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像。它还展示了不同的活体成像方法,以荧光标记视网膜的多个细胞队列。
视网膜将来自环境的光信号转换为传播到大脑的电信号。视网膜疾病很普遍,会导致视力障碍和失明。了解这些疾病如何进展对于制定新的治疗方法至关重要。疾病动物模型中的体内显微镜是了解神经变性的有力工具,并在治疗从阿尔茨海默病到中风等疾病方面取得了重要进展。鉴于视网膜是唯一可以通过光学方法固有的中枢神经系统结构,它自然适合体内成像。然而,晶状体和角膜的原生光学元件对有效的成像访问提出了一些挑战。
该协议概述了以细胞分辨率对小鼠视网膜中的细胞队列和结构进行体内双光子成像的方法,适用于急性和慢性持续时间的成像实验。它提供了使用一套标记技术(包括腺相关病毒 (AAV) 载体、转基因小鼠和无机染料)的视网膜神经节细胞 (RGC)、无分泌细胞、小胶质细胞和血管成像的示例。重要的是,这些技术扩展到视网膜的所有细胞类型,并描述了访问其他感兴趣细胞群的建议方法。还详细介绍了用于显示和量化的手动图像后处理的示例策略。这些技术直接适用于视网膜功能在健康和疾病中的研究。
中枢神经系统的体内可视化通常需要侵入性手术,如颅骨变薄和安装玻璃窗或光学中继透镜。视网膜是神经系统中唯一可以直接观察到的结构,无需侵入性准备,因为它本身接收来自环境的光。光学进入视网膜的便利性使其成为研究中枢神经系统的有吸引力的模型系统。
小鼠视网膜的实时荧光成像已被用于跟踪青光眼1,2,视神经损伤1,3,4和中风5模型中的RGC死亡,以及退行性疾病中小胶质细胞激活6,7,8和脉管系统9的变化。内在信号也可用于可视化光感受器10,11,12和视网膜色素上皮细胞13。许多视网膜活体成像方法使用专为眼科目的设计的高度专业化的设备6或高度修改的光学系统来校正角膜和晶状体的天然像差8,9,11,12,13,14。
本协议展示了一种以细胞分辨率对视网膜中的荧光信号进行体内成像的方法,利用部分校正小鼠眼睛前光学的基本方法。这种策略需要对通常用于大脑体内成像的多光子显微镜设置进行非常小的调整。由于这种方法易于设置,并且小鼠承受的压力很小,因此有利于在急性和慢性持续时间内进行延时实验。此外,标记单个视网膜成分(包括RGC,无杏碱细胞,小胶质细胞和脉管系统)的基于遗传和有机染料的程序与这种成像技术兼容,并且能够体内观察对视网膜功能至关重要的细胞类型和结构。这些工具可以适用于标记大多数其他神经元细胞类型以及视网膜的神经胶质和血管成分。
本文描述的双光子成像程序能够对小鼠视网膜进行纵向体内成像。在异氟醚下,可以在连续长达6小时或更长时间内获得同一视网膜区域的可重复图像。还可以使用细胞和血管标志物在不同的日子对小鼠进行成像,以定位相同的成像区域(图3)。为此目的,使用透明凝胶浸泡与盖玻片相结合,以前已应用于一系列程序,包括视网膜下注射的视网膜可视化,激光诱导的视网膜损伤模型和眼底成像20,21,22。
眼睛的解剖结构对体内成像提出了独特的挑战,因为小鼠角膜和晶状体的高光功率阻碍了通过瞳孔的直接成像而无法矫正。其他几种体内成像方法依赖于使用平凹隐形眼镜来矫正小鼠眼睛的前光学元件7,17,18,19。由于仅在角膜上进行光学校正,鼠标晶状体的高光功率导致不可避免的视差,特别是周边扫描视野中的结构,表现为不同Z平面上X-Y维度的拉伸和平移运动。为了最大限度地减少X和Y维度上与图像视差相关的失真,小鼠眼睛的方向必须使成像区域与视网膜的切线平面垂直于显微镜光路。这里描述的设置有利于精确操纵眼睛的角度以实现这种对齐。可调节的鼠标头支架允许沿两个轴旋转,允许在实验者滚动Z维度时轻松手动调整眼睛的角度,以最小化视差。这种倾斜还规避了瞳孔的视场停止效应,允许对视网膜的更大区域进行成像。头部支架的约束也大大减少了呼吸引起的运动伪影。
必须注意保持鼠标眼睛的清晰度,因为在连续成像过程中图像质量会随着不透明度而下降。在成像过程中频繁地重新涂抹润滑凝胶,并在每次成像后涂抹软膏,有助于防止眼睛干燥和出现混浊。一些角膜混浊会在24-48小时后自发消退。如本协议中所述,使用透明凝胶和盖玻片可提供与隐形眼镜7相似的图像质量和像差校正,同时允许更轻松地调整眼角,而无需重新对齐盖玻片。此外,该凝胶为眼睛提供持续的水合作用,使其可以进行长达数小时的急性成像。最后,由于盖玻片不接触角膜,因此对眼睛的刺激最小,这可能会降低重复成像的光学清晰度。
这种方法的局限性在于光学像差不能完全校正。虽然由于高视差,这严重降低了轴向分辨率,但可以在单图像平面中获得体细胞的定量测量。应该注意的是,由于视网膜神经元的荧光信号强度取决于该方法的样品对齐,因此基于激发和发射比率的传感器更适合于在不同成像会话中长期比较样品的实验。在系统级别校正光学像差的一种方法是自适应光学,它允许视网膜中的亚细胞分辨率8,9,14,21。然而,自适应光学需要高度专业化的设备和广泛的专业知识才能实现。
双光子体内视网膜成像的替代方法是共聚焦显微镜或检眼镜检查6。这里介绍的方法应该很容易转化为宽场或共聚焦显微镜。单光子成像可能更强大,并且由于通过眼睛的角膜和晶状体实现有效的双光子效应所必需的双光子激光的高能量,损坏视网膜的风险较小。为避免双光子激光损伤,最大激光功率的阈值应通过完成成像实验后检查整个视网膜和成像层中细胞类型的免疫染色来根据经验确定。在这里介绍的系统中,RGC被标记为泛RGC标记Rbpms,密度在高达45 mW成像功率时是正常的,而55 mW会导致RGC的显着损失(未显示)。
单光子成像的一个缺点是,与双光子成像相比,这种方法将非常严重地刺激视网膜的原生视觉电路23。先前使用视网膜整体安装或眼罩制剂的实验表明,双光子激光扫描引起的电路激活在很大程度上是瞬态的24。在这里,使用Ca 2+传感器Twitch2b对RGC活动进行成像显示,激光扫描的开始诱导Ca 2+抬高,在大多数RGC中,Ca 2+抬高在5-20秒的过程中恢复到基线(图8)。鉴于该协议中的激光功率在先前报告体内视网膜光响应8的实验范围内,目前描述的方法可能适用于记录视网膜中的电路活动。这些考虑对于可能受电路活动影响的实验非常重要。
该协议展示了两种类型的视网膜神经元,RGC和无分泌细胞的体内成像。可以实现其他主要细胞类型的类似标记,包括水平细胞(Cx57-Cre 25),双极细胞(Chx10-Cre 26;mGluR6-GFP 27),锥形光感受器(S-或M-视蛋白-Cre 28),杆状光感受器(Nrl-Cre 29),Müller胶质细胞(Foxg1-Cre 26)和周细胞(NG2-DsRed9)。转基因小鼠也可用于标记RGC的离散亚群(例如,αRGC30的KCNG4-Cre;OPN4-Cre 用于 ipRGC31;用于 J-RGC32 的 JAM-B-CreER)和无细胞(例如,用于星爆无红细胞26 的 ChAT-Cre 和用于各种无糖核细胞亚型 3,34 的神经肽启动子驱动物)。病毒载体可用于靶向特定细胞群,代替转基因小鼠。玻璃体内注射具有无处不在的CAG启动子元件的AAV2几乎完全标记RGC,无碱细胞和水平细胞25。将修饰的AAV2.7m8-Y444F衣壳与工程化的mGluR6启动子构建体配对,可以广泛标记ON双极细胞35。AAV的视网膜下注射导致光感受器的富集,血清型AAV2 / 5具有最高的转导效率36。Shh10是一种修饰的AAV6衣壳蛋白,与胶质原纤维酸性蛋白启动子元件配对已被证明对Müller胶质细胞37具有特异性。
用完全非侵入性的方法观察中枢神经系统细胞的能力可用于研究神经回路的基本特性8,以及神经变性3,4,5,6,38的机制。许多致盲疾病针对视网膜中的细胞群,小鼠体内成像方法已被用于研究视神经损伤1,3,4,黄斑变性13,中风5,青光眼2,6和葡萄膜炎7。此外,许多中枢神经系统神经退行性疾病表现在视网膜上,包括阿尔茨海默病39,多发性硬化症40和帕金森病41。因此,这种易于获得的视网膜活体成像技术可以用作研究各种神经退行性疾病的工具。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了预防失明研究基金会(PRW职业发展奖和圣路易斯华盛顿大学医学院眼科和视觉科学系的无限制资助),国家青光眼研究(BrightFocus基金会的一个项目)和麦克唐纳细胞和分子神经生物学中心的资助。Z.W.获得了机构国家研究服务奖T32 EY013360的支持。这项工作还得到了华盛顿大学医学院希望中心病毒载体核心的支持。
#1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm |
50 mL glass syringe | Hamilton | 80950 | 22G cemented needle |
Adeno-associated virus (AAV2) | Hope Center Viral Core | NA | |
Anesthesia Air Pump | RWD Life Science | R510-30 | |
Atropine | Sigma | A0132 | For pupil dilator solution |
Basic Small Animal Anesthesia Device | RWD Life Science | R500IE | |
Borosilicate glass capillary | Sutter | B150-86-10 | Outside diameter 1.50 mm, inside diameter 0.86 mm, length 10 cm |
CFP/YFP filter cube | Chroma | custom | 480/40, 505 long pass, 535/30 |
ChromoFlex – Two channel PMT detection unit | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
Circulating heating pump | Braintree Scientific | tp-700 | Set to 37 °C |
Cling film | VWR | 10713-916 | |
Compact Filter Holder | ThorLabs | DH1 | Holds coverslip over mouse eye |
Cx3cr1-GFP transgenic mice (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 005582 | |
DAQ controller chassis | National Instruments | PXIe-1073 | |
Data acquisition device | National Instruments | BNC-2090A | |
Evans Blue dye | Fisher Scientific | AAA1677409 | |
FPGA module with digitizer | National Instruments | NI-5734 | |
Gas Evacuation Apparatus | RWD Life Science | R546W | |
GenTeal Severe lubricant eye gel | Alcon | (from local pharmacy) | For use during imaging |
GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
Heating pad | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
HyperScope Launch Optics for use with Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
HyperScope Main module | Scientifica | S-MP-100466 | |
HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
ImageJ Fiji software | Freeware | ||
Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
Isoflurane gas filter cannister (active scavenging) | RWD Life Science | R510-31 | |
Isoflurane gas filter cannister (passive scavenging) | RWD Life Science | R510-31S | |
ketamine HCl (100 mg/mL) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
M32 to M26 adapter | ThorLabs | M32M26S | |
MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
micropipette puller | Sutter | Flaming/Brown Model P-97 | |
Mineral oil | Fisher | BP2629-1 | |
Mini bulldog hemostatic clamp | Fine Science Tools | 18053-28 | |
Miniature EVA Tubing 0.02" ID, 0.06" OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
Miniature EVA Tubing 0.05" ID, 0.09" OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
Mouse head holder | Narishige | SGM-4 | |
No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
Optical power meter kit | ThorLabs | PM100D | |
pE-300 Ultra LLG Deivery | Scientifica | COO-LED3ULLGs | |
Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | For pupil dilator solution |
Pockels cell | Conoptics | 350-80-02 | |
Pockels cell amplifier | Conoptics | Model 302RM | |
Proparacaine hydrochloride | Sigma | 1571001 | For eye immobilization |
Red & Far Red short pass filter Cube | Chroma | custom | 560 short pass |
Rotating 1/2" post clamp | ThorLabs | SWC | |
ScanImage package | Vidrio Technologies | Freeware | Image acquisition software; Version 5.4.0 (2018); requires MATLAB |
sodium chloride solution, sterile (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 E | |
Tabletop centrifuge | Oxford | Benchmate C8 | |
Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic ophthalmic ointment | Zoetisus | NA | For use after intravitreal injection |
ThermoRack cooling system | Solid State Cooling Systems | ThermoRack 401 | Set to 20 °C |
Ultrafast Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
Vgat-Cre transgenic mice (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016962 | |
VGlut2-Cre transgenic mice (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | The Jackson Laboratory | 016963 | |
VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ointment | Stye | NA | For use after imaging |
xylazine HCl (20 mg/mL) | Akorn | NDC 59399-110-20 |