We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.
De vuurstilte Thermobia domestica is een ametabolische, vleugelloze soort die geschikt is voor het bestuderen van de ontwikkelingsmechanismen van insecten die hebben geleid tot hun succesvolle evolutionaire straling op aarde. De toepassing van genetische instrumenten zoals genoombewerking is de sleutel tot het begrijpen van genetische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor evolutionaire transities in een Evo-Devo-benadering. In dit artikel beschrijven we ons huidige protocol voor het genereren en onderhouden van mutante stammen van T. domestica. We rapporteren een droge injectiemethode, als alternatief voor de gerapporteerde natte injectiemethode, waarmee we stabiel hoge overlevingspercentages in geïnjecteerde embryo’s kunnen verkrijgen. We rapporteren ook een geoptimaliseerde omgevingsinstelling om volwassenen te paren en volgende generaties met een hoog rendement te verkrijgen. Onze methode onderstreept het belang om rekening te houden met de unieke biologie van elke soort voor de succesvolle toepassing van genoombewerkingsmethoden op niet-traditionele modelorganismen. We voorspellen dat deze genoombewerkingsprotocollen zullen helpen bij de implementatie van T. domestica als laboratoriummodel en om de ontwikkeling en toepassing van nuttige genetische hulpmiddelen bij deze soort verder te versnellen.
Thermobia domestica behoort tot een van de meest basale insectenorden, Zygentoma, die een voorouderlijke ametaboleuze en vleugelloze levenscyclus behoudt. Een dergelijke basale fylogenetische positie en voorouderlijke kenmerken stellen deze soort als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het succes van insecten op aarde, die meer dan 70% van de beschreven diersoorten bestrijken1. T. domestica wordt al lang voornamelijk gebruikt om voorouderlijke kenmerken van insectenfysiologie te bestuderen vanwege de geschikte kenmerken als laboratoriummodel, zoals een relatief korte levenscyclus (2,5-3,0 maanden van embryo tot reproductieve volwassene; Figuur 1A) en een gemakkelijke fokkerij. In de afgelopen drie decennia is het gebruik ervan uitgebreid om voorouderlijke kenmerken van verschillende eigenschappen zoals lichaamsplan, neurale differentiatie en circadiane ritmes2,3,4te onderzoeken.
De toepassing van geavanceerde genetische instrumenten in T. domestica zou dergelijke bijdragen op een breed onderzoeksgebied verder kunnen versnellen. Succesvolle RNA interferentie (RNAi)-gemedieerde gen knockdown in embryo’s, nimfen en volwassenen is gemeld in T. domestica4,5,6. De efficiëntie van systemische RNAi is nog steeds sterk afhankelijk van soorten – het is bijvoorbeeld over het algemeen hoog in coleoptera, terwijl het laag is in de lepidoptera-orde7. De efficiëntie en duur van de RNAi knockdown in T. domestica moet nog worden beoordeeld. Naast RNAi, hebben we eerder gemeld een succesvolle CRISPR / Cas9-gemedieerde gen knock-out in T. domestica8. Het CRISPR/Cas-systeem is op grote schaal toegepast voor genoombewerking bij insecten, met name voor gerichte gen knock-out. Het gebruik ervan kan worden uitgebreid voor andere toepassingen, zoals genverslaggevertest, cellijntracking en manipulatie van transcriptieactiviteit door exogene constructies in te kloppen na de vaststelling van een protocol voor het leveren van componenten van het CRISPR/Cas-systeem inkernen 9. In combinatie met de gepubliceerde genoomassemblage10zou het brede gebruik en de verdere ontwikkeling van de CRISPR/Cas-gebaseerde genoombewerking in T. domestica studies vergemakkelijken die zich richten op de evolutionaire mechanismen achter het uitstekende adaptieve succes van insecten. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor embryomicro-injectie en voor het paren van volwassen T. domestica om een mutante stam te genereren met CRISPR/Cas9. Gezien deze nieuwe methode bespreken we het belang van het overwegen van de unieke biologie van niet-traditionele modelsoorten voor succesvolle toepassingen van deze technieken.
Voor de succesvolle generatie van de gewenste T. domestica mutant met CRISPR/Cas9 is het eerst belangrijk om een voldoende aantal geënsceneerde embryo’s te verzamelen voor injectie. Voor een constante verzameling van een voldoende aantal T. domestica-eieren, is de sleutel om een geschikte grootte van de container te selecteren om een lagere populatiedichtheid te hebben, omdat het zou helpen bij het succesvol voltooien van een reeks complex paringsgedrag, dat wordt herhaald na elke vervelling voor volwa…
The authors have nothing to disclose.
TO en TD werden ondersteund door respectievelijk JSPS KAKENHI-subsidienummers 19H02970 en 20H02999.
24-well plate | Corning | 83-3738 | |
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |