البيض Microinjection وكفاءة التزاوج لتحرير الجينوم في Firebrat ثيرامبيا المحلية
Summary
نحن نقدم بروتوكول مفصل لتربية, microinjection من البيض و التزاوج كفاءة من firebrat ثيرامبيا المحلية لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة بعد تحرير الجينوم.
Abstract
وdybrat ثيرامبيا المحلية هي الأنواع غير المنيع ، الجناح الذي هو مناسبة لدراسة آليات النمو للحشرات التي أدت إلى إشعاعها التطوري الناجح على الأرض. إن تطبيق الأدوات الوراثية مثل تحرير الجينوم هو المفتاح لفهم التغيرات الوراثية المسؤولة عن التحولات التطورية في نهج إيفو ديفو. في هذه المقالة، ونحن وصف البروتوكول الحالي لتوليد والحفاظ على سلالات متحولة من T. المحلية. نحن نبلغ عن طريقة الحقن الجاف ، كبديل لطريقة الحقن الرطب المبلغ عنها ، التي تسمح لنا بالحصول على معدلات بقاء عالية بشكل ثابت في الأجنة المحقونة. كما أننا نبلغ عن بيئة مثالية لتزاوج البالغين والحصول على الأجيال اللاحقة بكفاءة عالية. وتؤكد طريقتنا على أهمية أخذ البيولوجيا الفريدة لكل نوع في الاعتبار للتطبيق الناجح لطرق تحرير الجينوم على الكائنات الحية النموذجية غير التقليدية. ونتنبأ بأن بروتوكولات تحرير الجينوم هذه ستساعد في تنفيذ T. domestica كنموذج مختبري وعلى زيادة تسريع تطوير وتطبيق أدوات جينية مفيدة في هذا النوع.
Introduction
ينتمي ثيرامبيا المحلية إلى واحدة من أكثر أوامر الحشرات القاعدية ، Zygentoma ، التي تحتفظ بدورة حياة غير اثيرية وغير جناحية. هذه الحالة الفينوغرافية القاعدية وخصائص الأجداد هذه الأنواع هي نموذج جذاب لدراسة الآليات الكامنة في نجاح الحشرات على الأرض، والتي تغطي أكثر من 70٪ من الأنواع الحيوانية الموصوفة1. T. المحلية منذ فترة طويلة تستخدم أساسا لدراسة خصائص الأجداد من علم وظائف الأعضاء الحشرية بسبب ميزات مناسبة كنموذج مختبري، مثل دورة حياة قصيرة نسبيا (2.5-3.0 أشهر من الجنين إلى البالغين الإنجابية؛ الشكل 1أ) وتربية سهلة. في العقود الثلاثة الماضية، تم توسيع استخدامه للتحقيق في خصائص الأجداد من مختلف الصفات مثل خطة الجسم، والتمايز العصبي، والإيقاعات circadian2،3،4.
ويمكن أن يؤدي تطبيق الأدوات الجينية المتقدمة في مجال ت. محلي() إلى زيادة التعجيل بهذه المساهمات في مجال بحثي واسع. تم الإبلاغ عن التدخل الناجح للرنا (RNAi) -بوساطة الجينات في الأجنة والحوريات والبالغين في T. المحلية4,5,6. لا تزال كفاءة RNAi النظامية تعتمد على الأنواع بشكل كبير – على سبيل المثال ، فهي عالية بشكل عام في coleoptera في حين أنها منخفضة في أمر lepidoptera7. ولم يتم بعد تقييم كفاءة ومدة الضربة القاضية لـ RNAi في T. domestica. بالإضافة إلى RNAi، وقد أبلغنا سابقا ناجحة CRISPR / Cas9-بوساطة الجينات بالضربة القاضية في T. المحلية8. وقد تم تطبيق نظام CRISPR / Cas على نطاق واسع لتحرير الجينوم في الحشرات خاصة بالنسبة للجين المستهدف بالضربة القاضية. ويمكن توسيع استخدامه لتطبيقات أخرى مثل مقايسة مراسل الجينات ، وتتبع نسب الخلية ، والتلاعب في النشاط النسخي عن طريق طرق في المنشآت الخارجية بعد إنشاء بروتوكول لتسليم مكونات نظام CRISPR / Cas في النوى9. جنبا إلى جنب مع الجمعية الجينومالمنشورة 10، والاستخدام على نطاق واسع وزيادة تطوير تحرير الجينوم CRISPR / Cas القائم على CAS في T. المحلية من شأنه أن يسهل الدراسات التي تركز على الآليات التطورية وراء النجاح التكيفي المعلقة للحشرات. هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل للجنين microinjection والتزاوج الكبار T. المحلية لتوليد سلالة متحولة باستخدام CRISPR / Cas9. وبالنظر إلى هذه الطريقة الجديدة، فإننا نناقش أهمية النظر في البيولوجيا الفريدة للأنواع النموذجية غير التقليدية للتطبيقات الناجحة لهذه التقنيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالنسبة للجيل الناجح من المتحولة T. domestica المرغوب فيها مع CRISPR/Cas9 ، من المهم أولاً جمع عدد كاف من الأجنة المرحلية للحقن. للحصول على مجموعة ثابتة من عدد كاف من البيض المحلي T. ، فإن المفتاح هو تحديد حجم مناسب للحاوية ليكون لها كثافة سكانية أقل لأنها ستساعد على الانتهاء بنجاح من سلسلة م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم TO و TD من قبل أرقام منحة JSPS KAKENHI 19H02970 و 20H02999 على التوالي.
Materials
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. . Insect Hormones. , (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
