Summary

Isolamento e analisi delle lipoproteine plasmatiche mediante ultracentrifugazione

Published: January 28, 2021
doi:

Summary

Diversi metodi sono stati utilizzati per analizzare le lipoproteine plasmatiche; tuttavia, l’ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. Qui descriviamo un metodo su come isolare le lipoproteine dal plasma usando l’ultracentrifugazione a densità sequenziale e come analizzare le apolipoproteine sia a scopo diagnostico che di ricerca.

Abstract

L’analisi delle lipoproteine plasmatiche e delle apolipoproteine è una parte essenziale per la diagnosi di dislipidemia e gli studi sul metabolismo lipidico e sull’aterosclerosi. Sebbene esistano diversi metodi per analizzare le lipoproteine plasmatiche, l’ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. A causa della sua procedura di separazione intatta, le frazioni di lipoproteina isolate con questo metodo possono essere utilizzate per l’analisi di lipoproteine, apolipoproteine, proteomi e studio funzionale delle lipoproteine con cellule coltivate in vitro. Qui forniamo un protocollo dettagliato per isolare sette frazioni di lipoproteina tra cui VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1,10 e 1,21 g/mL) dal plasma di coniglio utilizzando ultracentrifugazione galleggiante sequenziale. Inoltre, introduciamo ai lettori come analizzare le apolipoproteine come apoA-I, apoB e apoE di SDS-PAGE e Western blotting e mostriamo risultati rappresentativi dei profili di lipoproteina e apolipoproteina utilizzando modelli di coniglio iperlipidemico. Questo metodo può diventare un protocollo standard sia per i medici che per gli scienziati di base per analizzare le funzioni della lipoproteina.

Introduction

La dislipidemia è il principale fattore di rischio della malattia aterosclerotica nel mondo. Alti livelli di lipoproteine a bassa densità (LDL) e bassi livelli di lipoproteine ad alta densità (HDL) sono strettamente associati ad un alto rischio di malattie coronarica (CHD)1,2. Nell’ambiente clinico, sia il colesterolo LDL (LDL-C) che il colesterolo HDL (HDL-C) vengono misurati regolarmente utilizzando un analizzatore automatizzato in un laboratorioclinico 3,4. Nonostante ciò, è essenziale analizzare i profili di lipoproteina nei dettagli per la diagnosi di dislipidemia e lo studio del metabolismo lipidico e dell’aterosclerosi negli animali umani e sperimentali. Diversi metodi sono stati segnalati per analizzare le lipoproteine plasmatiche come l’ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione delle dimensioni [cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) e cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)], l’elettroforesi da gel di agarosio e poliacrilammide, risonanza magnetica nucleare e precipitazioni chimiche selettive usando polianioni e formazioni divalenti o altre sostanze chimiche. Negli anni ’50, il gruppo di Havel propose per la prima volta il concetto di lipoproteine definite dalle densità usando l’ultracentrifugazione e le classificò in chilomicroni (CM), lipoproteine a bassissimo densità (VLDL), lipoproteine a densità intermedia (IDL), LDL e HDL5 e successivamente, il metodo fu ulteriormente modificato da altrigruppi 6,7. Fino ad ora, l’ultracentrifugazione è il metodo più popolare e affidabile mentre il protocollo pratico non è ancora disponibile. In questo documento, abbiamo cercato di descrivere un protocollo facile da usare per isolare una piccola scala di plasma usando l’ultracentrifugazione galleggiante a densità sequenziale originariamente descrittain precedenza 8. Isolamento di sette frazioni plasmatiche lipoproteine [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1.10, e 1.21 g/mL)] consente ai ricercatori di effettuare un'analisi approfondita sia delle lipoproteine che delle loro apolipoproteine compositive9,10,11. Le lipoproteine intatte a sette densità consecutive possono essere utilizzate per analizzare le funzioni della lipoproteina e servire anche a strategie in vitro basate su cellule. Questo protocollo dovrebbe essere utile sia per la diagnosi clinica che per la ricerca di base. Qui abbiamo usato il plasma di coniglio come esempio per dimostrare questa tecnica mentre il plasma di altre specie può essere applicato allo stesso modo.

Protocol

Tutte le procedure per gli studi sui conigli sono state eseguite con l’approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università di Yamanashi (numero approvato: A28-39). 1. Separazione al plasma dal sangue di coniglio Preparare microtubi da 1,5 mL contenenti 15 μL di 0,5 M EDTA (pH 8,0) per la raccolta del sangue. Mettere un coniglio in un trattiere e forare un’arteria intermedia auricolare usando un ago calibro 22 e raccogliere il sangue i…

Representative Results

Utilizzando questo protocollo, abbiamo isolato le lipoproteine di coniglio usando 1 mL di plasma e ottenuto sette frazioni di densità. Le frazioni di densità isolate sono sufficienti per misurare lipidi e apolipoproteine come descritto sopra per la maggior parte degli scopi di ricerca. La stessa procedura può essere utilizzata anche per isolare le lipoproteine plasmatiche dall’uomo e da altre specie. Per animali di piccole dimensioni come i topi, è necessario plasma in pool. La figura 3 …

Discussion

L’iperlipidemia è uno dei principali fattori di rischio della malattia aterosclerotica. Pertanto, l’analisi delle lipoproteine plasmatiche non è solo essenziale per la diagnosi di pazienti con dislipidemia, ma anche importante per lo studio dei meccanismi molecolari del metabolismo della lipoproteina e dell’aterosclerosi. In questo studio, abbiamo descritto il protocollo di isolamento e analisi delle lipoproteine plasmatiche che può essere applicato nei laboratori in cui è disponibile l’ultracentrifugazione. Le infor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di ricerca del JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, della National Natural Science Foundation of China (n. 81941001 e 81770457), JSPS-CAS nell’ambito del Japan-China Research Cooperative Program.

Materials

22-gauge needle Terumo NN-2232S For blood collection
96-well microplate greiner bio-one 655101 For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody LifeSpan BioSciences LS-C314186 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody ROCKLAND 600-101-111 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody Merck Millipore AB947 For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 299-50101 For apolipoprotein analysis
Centrifuge HITACHI himac CF15RN
Closure Spectrum 132736 For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing FUJIFILM Wako Pure Chemical 043-30921 For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block Major Science MD-01N For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 For Western blotting
Electrophoresis Chamber BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate FUJIFILM Wako Pure Chemical 345-01865 For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper ADVANTEC 590 For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor BECKMAN COULTER 357656 TLA-120.2
Fixing solution For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane BIO-RAD 1620177 For Western blotting
Lumino image analyzer GE Healthcare For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer ADVANTEC SR-304 For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK BIO-RAD For lipids measurment
Microtube INA-OPTIKA SC-0150
Orbital agitator USBDbo Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody Jackson ImmunoResearch 705-035-003 For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 715-035-150 For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 433-36201 For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes BECKMAN COULTER 343778
Potassium Bromide FUJIFILM Wako Pure Chemical 168-03475 For density solution
Power Supply BIO-RAD For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra BIO-RAD 161-0377 For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer Natsume Seisakusho KN-318 For blood collection
Rotor HITACHI T15A43
SDS-PAGE running buffer 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x) 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel 4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder FUJIFILM Wako Pure Chemical 190-12865 For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 439-17501 For lipids measurment
Triglyicerides assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 432-40201 For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube BECKMAN COULTER 347960 For lipoprotein isolation
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379 For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A95761 Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell

References

  1. Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
  2. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  3. Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
  4. Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
  5. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
  6. Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
  7. Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
  8. Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
  9. Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
  10. Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
  11. Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
  12. Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
  13. Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
  14. Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
  15. Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
  16. von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
  17. Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
  18. Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
  19. De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
  20. Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).

Play Video

Cite This Article
Niimi, M., Yan, H., Chen, Y., Wang, Y., Fan, J. Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation. J. Vis. Exp. (167), e61790, doi:10.3791/61790 (2021).

View Video