Isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen door ultracentrifugatie
Summary
Verschillende methoden zijn gebruikt voor het analyseren van plasma lipoproteïnen; ultracentrifugatie is echter nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Hier beschrijven we een methode met betrekking tot het isoleren van lipoproteïnen uit plasma met behulp van sequentiële dichtheid ultracentrifugatie en hoe de apolipoproteïnen te analyseren voor zowel diagnostische als onderzoeksdoeleinden.
Abstract
Analyse van plasma lipoproteïnen en apolipoproteïnen is een essentieel onderdeel voor de diagnose van dyslipidemie en studies van lipidemetabolisme en atherosclerose. Hoewel er verschillende methoden zijn voor het analyseren van plasma lipoproteïnen, is ultracentrifugatie nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Vanwege de intacte scheidingsprocedure kunnen de lipoproteïnefracties die door deze methode worden geïsoleerd, worden gebruikt voor analyse van lipoproteïnen, apolipoproteïnen, proteomen en functionele studie van lipoproteïnen met gekweekte cellen in vitro. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om zeven lipoproteïnefracties te isoleren, waaronder VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), MOL's (d=1,04 en 1,06 g/ml), HDL's (d=1,08, 1,10 en 1,21 g/ml) uit konijnenplasma met behulp van sequentiële zwevende ultracentrifugatie. Daarnaast introduceren we de lezers hoe ze apolipoproteïnen zoals apoA-I, apoB en apoE kunnen analyseren door SDS-PAGE en Western blotting en tonen we representatieve resultaten van lipoproteïne- en apolipoproteïneprofielen met behulp van hyperlipidemische konijnenmodellen. Deze methode kan een standaardprotocol worden voor zowel clinici als basiswetenschappers om lipoproteïnefuncties te analyseren.
Introduction
Dyslipidemie is de belangrijkste risicofactor van atherosclerotische ziekte in de wereld. Hoge niveaus van lage dichtheid lipoproteïnen (MOL’s) en lage niveaus van high-density lipoproteïnen (HDL ‘s) zijn nauw geassocieerd met een hoog risico op coronaire hartziekten (CHD)1,2. In de klinische setting worden zowel LDL-cholesterol (LDL-C) als HDL-cholesterol (HDL-C) routinematig gemeten met behulp van een geautomatiseerde analysator in een klinisch laboratorium3,4. Desondanks is het essentieel om lipoproteïneprofielen in detail te analyseren voor de diagnose van dyslipidemie en de studie van lipidemetabolisme en atherosclerose bij menselijke en experimentele dieren. Verschillende methoden zijn gemeld om plasma lipoproteïnen te analyseren, zoals ultracentrifugatie, grootte uitsluiting chromatografie [snelle eiwit vloeibare chromatografie (FPLC) en high performance vloeibare chromatografie (HPLC)], elektroforese door agarose en polyacrylamide gels, nucleaire magnetische resonantie, en selectieve chemische neerslag met behulp van polyanionen en divalente kationen of andere chemicaliën. In de jaren 1950 stelde havels groep voor het eerst het concept van lipoproteïnen voor dat werd gedefinieerd door dichtheden met behulp van ultracentrifugatie en classificeerde ze in chylomicronen (CM), lipoproteïnen met een zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met gemiddelde dichtheid (IDL), LDL en HDL5 en later werd de methode verder gewijzigd door andere groepen6,7. Tot nu toe is ultracentrifugatie de meest populaire en betrouwbare methode, terwijl het praktische protocol nog steeds niet beschikbaar is. In dit artikel hebben we geprobeerd een gebruiksvriendelijk protocol te beschrijven voor het isoleren van een kleine schaal van plasma met behulp van sequentiële dichtheid zwevende ultracentrifugatie oorspronkelijk eerder beschreven8. Isolatie van zeven plasma lipoproteïnefracties [VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), MOL's (d=1,04 en 1,06 g/ml), HDL's (d=1,08, 1.10, en 1.21 g/ml)] stelt onderzoekers in staat om een uitgebreide analyse te maken van zowel lipoproteïnen als hun compositorische apolipoproteïnen9,10,11. De intacte zeven opeenvolgende dichtheid lipoproteïnen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van lipoproteïnefuncties en ook dienen voor celgebaseerde in vitro strategieën. Dit protocol moet nuttig zijn voor zowel klinische diagnose als fundamenteel onderzoek. Hier gebruikten we konijnenplasma als voorbeeld om deze techniek aan te tonen, terwijl plasma van andere soorten op dezelfde manier kan worden toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hyperlipidemie is een van de belangrijkste risicofactoren van atherosclerotische ziekte. Zo is analyse van plasma-lipoproteïnen niet alleen essentieel voor de diagnose van dyslipidemiepatiënten, maar ook belangrijk voor onderzoek naar moleculaire mechanismen van lipoproteïnemetabolisme en atherosclerose. In deze studie beschreven we het protocol van isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen dat kan worden toegepast in de laboratoria waar ultracentrifugatie beschikbaar is. Informatie verkregen met deze methode is u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een onderzoeksbeurs van JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, de National Natural Science Foundation of China (Nr. 81941001 en 81770457), JSPS-CAS in het kader van het Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
