Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) biedt een krachtig platform voor bacteriële studies, waardoor resolutie op nanoschaal kan worden bereikt. Zowel het in kaart brengen van subcellulaire veranderingen (bijvoorbeeld bij celdeling) als vergelijkende studies van de chemische samenstelling (bijvoorbeeld als gevolg van medicijnresistentie) kunnen worden uitgevoerd op een enkel celniveau in bacteriën.
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is een nieuwe combinatorische techniek, die gelijktijdige karakterisering van fysische eigenschappen en chemische samenstelling van monster met nanoschaalresolutie mogelijk maakt. Door AFM te combineren met IR wordt de ruimtelijke resolutiebeperking van conventionele IR overwonnen, waardoor een resolutie van 20-100 nm kan worden bereikt. Dit opent de deur voor een breed scala aan nieuwe toepassingen van IR in de richting van het onderzoeken van monsters kleiner dan enkele micrometers, voorheen onhaalbaar door middel van conventionele IR-microscopie. AFM-IR is bij uitstek geschikt voor bacterieel onderzoek en levert zowel spectrale als ruimtelijke informatie op enkelcellig en intracellulair niveau. De toenemende wereldwijde gezondheidsproblemen en ongunstige toekomstvoorspellingen met betrekking tot bacteriële infecties, en vooral de snelle ontwikkeling van antimicrobiële resistentie, hebben een dringende behoefte gecreëerd aan een onderzoeksinstrument dat in staat is tot fenotypisch onderzoek op het niveau van één cel en subcellulair niveau. AFM-IR biedt het potentieel om aan deze behoefte te voldoen, door gedetailleerde karakterisering van de chemische samenstelling van een enkele bacterie mogelijk te maken. Hier bieden we een compleet protocol voor monstervoorbereiding en gegevensverzameling van enkele spectra en mapping modaliteit, voor de toepassing van AFM-IR op bacteriële studies.
Bacteriën zijn eencellige prokaryote organismen, die in verschillende vormen en maten voorkomen, meestal in het bereik van enkele honderden nanometers tot micrometers. Ze bestaan in verschillende habitats en zijn essentieel voor het bestaan van leven. In het menselijk lichaam zijn de meeste bacteriën in de darm onschadelijk en velen zijn in feite gunstig1. Verschillende bacteriesoorten zijn echter pathogeen en veroorzaken een reeks infectieziekten. Bacteriële infecties kunnen leiden tot de ontwikkeling van sepsis en septische shock: een levensbedreigende aandoening, als gevolg van de reactie van het lichaam op een infectie2. Sepsis is een wereldwijde grote bedreiging voor de gezondheid, met een hoge prevalentie wereldwijd en ernstige sterftecijfers. Alleen al in 2017 werden wereldwijd naar schatting 50 miljoen gevallen van sepsis geregistreerd, waarvan 11 miljoen met de dood tot gevolg (ongeveer 20%)2. Bovendien bleek een afname van de overlevingskansen van de patiënt, als gevolg van vertraagde therapie, op uurbasis op te treden3,4.
Bacteriële infecties worden behandeld met antibiotica. De ernst van de mogelijke gevolgen van bacteriële bloedbaaninfecties (BSFI’s), samen met een duidelijke betekenis van snelle start van antimicrobiële therapie, leiden tot de noodzaak van onmiddellijke toediening van antibiotica. Omdat de huidige diagnostische benaderingen die in de klinische praktijk worden gebruikt (bijv. Bloedkrijven) echter relatief lang duren, vindt toediening van antibiotica vaak plaats voorafgaand aan een positieve BSI-diagnose5. Deze factor leidt tot uitgebreid overmatig gebruik van antibiotica, wat – samen met overmatig antibioticagebruik in andere sectoren zoals de landbouw – een ernstige evolutionaire druk creëert in de richting van de ontwikkeling van antimicrobiële resistentie (AMR)6,7. AMR is momenteel een van de meest urgente wereldwijde gezondheidsproblemen7,8 en zal naar verwachting in 2050 de belangrijkste doodsoorzaak worden9. De ontwikkeling van resistentie, samen met de verspreiding van AMR-stammen, vindt plaats in eenalarmerend tempo7,8,9 en overtreft veruit de snelheid van ontdekking van nieuwe antibiotica10. Wereldwijd zijn er voortdurend nieuwe resistente fenotypen in opkomst, terwijl
onderzoek gericht op het begrijpen van de AMR-gerelateerde veranderingen is vaak traag en beperkt door beschikbare benaderingen11. Bovendien richten de veelgebruikte methoden, zoals polymerasekettingreactie (PCR) en whole gene sequencing (WGS), zich alleen op genotypische veranderingen. Deze zijn niet voldoende om de mechanismen vanresistentie 11te onthullen , waardoor er dringend behoefte is aan een onderzoeksinstrument waarmee de chemische samenstelling van bacteriën kan worden begrepen.
Infraroodspectroscopie (IR) biedt een moleculaire karakterisering van het monster en is dus een veelbelovende kandidaat voor fenotypische bacteriële spleet. Sinds de vroege toepassingen12, werd een grote omvang van voorbeelden van het gebruik ervan aangetoond in de literatuur13,14. Deze omvatten fenotypische identificatie van bacteriën op genus15,soort16en stam17,18 niveau. De ruimtelijke resolutie van conventionele IR is echter beperkt tot enkele micron vanwege de golflengtediffractie ruimtelijke resolutielimiet19. Aangezien de grootte van de meeste bacteriën onder die limiet ligt (bijv. Staphylococcus aureus ≈ diameter van 400 nm), is conventionele IR niet van toepassing op onderzoek op eencellig of intracellulair niveau.
De beperking van de ruimtelijke resolutie werd onlangs overwonnen door IR-spectroscopie te combineren met Atomic Force Microscopy (AFM-IR). In dit geval wordt de IR-absorptie indirect gedetecteerd, door thermische uitzetting van het materiaal19,20,21,22. Kortom, de absorptie van IR-straling resulteert in een lokale temperatuurstijging. Dit kan direct23 worden gemeten of door de meting van oscillatie van de AFM cantilever-sonde, als gevolg van krachtimpuls gecreëerd door IR-absorptie20,21. De combinatorische AFM-IR-techniek maakt het mogelijk om een ruimtelijke resolutie van bijna 20 nm te bereiken, waardoor gelijktijdig informatie wordt verstrekt over lokale fysische eigenschappen van een monster (AFM) en de chemische samenstelling ervan (AFM-IR). Verzameling van beide, enkele spectra van geselecteerde plekken en het in kaart brengen van de intensiteit van geselecteerde golfnummerwaarden binnen een gekozen gebied zijn mogelijk.
Gezien de haalbare ruimtelijke resolutie van AFM-IR, is het duidelijk dat de techniek de mogelijkheid opent van chemisch / fenotypisch onderzoek van enkele bacteriecellen en hun intracellulaire samenstelling24. Tot nu toe werden verschillende voorbeelden van de toepassing van AFM-IR voor afzonderlijke bacteriën aangetoond in de literatuur19,20,21,22,25,26,27,28. Deze omvatten enkelvoudige spectrale analyse19,21,22 en mapping op subcellulair niveau19,22,25,26,27,28. Het vermogen om intracellulaire lipide blaasjes27 en virussen28 binnen één bacterie te detecteren, is bijvoorbeeld beschreven. Deze resultaten tonen het nut aan van AFM-IR voor studies op nanoschaal van afzonderlijke bacteriën en klinisch relevante pathogenen19.
Daarom presenteren we een monstervoorbereidings- en verzamelmethode voor AFM-IR-gegevens van meerlaagse, monolaagse en eencellige bacteriële monsters. Het hierin beschreven protocol werd toegepast om verschillende soorten bacteriën22 en de veranderingen in hun chemische samenstelling te bestuderen. In het bijzonder werd de in vivo ontwikkeling van vancomycineresistentie en daptomycine niet-gevoeligheid onderzocht in klinische paren van S. aureus19. Zowel vancomycine intermitterende resistentie als daptomycine niet-gevoeligheid in S. aureus (VISA en DpR) ontstonden relatief recent, na het toegenomen gebruik en de introductie van deze antibiotica in klinieken, wat een aanzienlijk medisch probleem vormt. Bovendien blijft met name het mechanisme van niet-gevoeligheid voor daptomycine nog steeds ongrijpbaar, waardoor de ontwikkeling van alternatieve geneesmiddelen wordt belemmerd19,29. Het gepresenteerde protocol richt zich op het leveren van betrouwbare AFM-IR-spectra van afzonderlijke bacteriën, die verder kunnen worden geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid aan chemometrische benaderingen, volgens de experimentele doelstellingen. Het omvat bovendien de mapping-benadering, die van toepassing is op intracellulaire studies.
Het nut van IR-spectroscopie voor de karakterisering van een breed scala aan biologische monsters in de context van hun chemische samenstelling is goed vastgesteld. In het afgelopen decennium is IR-spectroscopie naar voren gekomen als een veelbelovend hulpmiddel voor bacteriële studies12,13,14,15,16,17. Het blijft aanzienlijke belangstelling trekken op het gebied van microbiologie, als een van de weinige technieken die een fenotypische karakterisering door de chemische samenstelling mogelijk maken. In deze context ligt het grootste nadeel van conventionele FTIR-microscopie in een beperkte ruimtelijke resolutie, waardoor eencellige en subcellulaire studies van bacteriën worden voorkomen. In feite vormt de kleine omvang van bacteriën een belemmering, niet alleen voor IR, maar voor de overgrote meerderheid van de technieken. De beschikbare onderzoeksinstrumenten voor eencellige en subcellulaire studies van bacteriën zijn dus aanzienlijk beperkt. De combinatie van AFM met IR maakt het mogelijk om de ruimtelijke resolutiebeperking van IR-spectroscopie te overwinnen, wat een nieuw hulpmiddel biedt voor bacterieel onderzoek, dat in staat is om op nanoschaal de chemische samenstelling te onderzoeken.
De techniek is niet beperkt tot eencellige studies en stelt men in staat om een verscheidenheid aan monsters te onderzoeken, variërend in dikte. Ongetwijfeld is een schone en zorgvuldige monstervoorbereiding van cruciaal belang voor het bereiken van afbeeldingen van hoge kwaliteit. Het protocol hierin biedt een methode om meerlaagse, monolaagse en /of eencellige monsters van verschillende bacteriën te bereiden(figuur 1). Het bereide monster is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de initiële bacteriële belasting, verdunning na het wassen en verdere verdunning op het substraat. De hoeveelheid monster die wordt verkregen na het verdunnen van de gewassen pellets en voorafgaand aan de afzetting op het substraat, maakt het meestal mogelijk om talrijke monsters te bereiden. Daarom is het, om de gewenste verdeling van het monster op het substraat te verkrijgen, vaak gunstig om een reeks monsters te bereiden, variërend in hun verdunning. Voor studies die gericht zijn op het verzamelen van AFM-IR-spectra in plaats van subcellulaire beeldvorming, kan het wijzigen van de hoeveelheid monster (bijvoorbeeld van monolaag naar meerlaags) gunstig zijn om de intensiteit van het signaal te verhogen.
Een ander cruciaal aspect bij de monstervoorbereiding is de juiste verwijdering van mediumresten. Afhankelijk van de geselecteerde kweekmethoden van het monster wordt het monster verzameld uit vloeibaar medium of uit een agarplaat. In beide gevallen is het mediumresidu waarschijnlijk aanwezig in het monster, zij het in veel mindere mate bij verzameling van agarplaten. Omdat bacteriële groeimedia een overvloed aan verschillende biologische componenten bevatten, is het van cruciaal belang om te zorgen voor een geschikte verwijdering van het medium. We raden drie wasbeurten met ultrapijn water aan voor agarplaatmonsters en ten minste vier wasbeurten voor monsters die zijn verzameld uit medium. Het aantal wasbeurten kan worden verhoogd, indien nodig; voor vergelijking tussen verschillende monsters is het echter belangrijk om het consistent te houden tussen monsters. Het gedemonstreerde protocol maakt gebruik van water, in plaats van oplosmiddelen zoals fosfaatbufferoplossing (PBS) of zoutoplossing. Zowel PBS als zoutoplossing leiden bij het drogen tot de vorming van kristallen, die de bacteriën kunnen beschadigen. Bovendien zijn beide een bron van intense IR-banden, waarbij PBS in het bijzonder meerdere banden in het vingerafdrukgebied bevat. Het gebrek aan vermogen voor het gebruik van zoutoplossing of PBS, vormt momenteel een belangrijke beperking voor de techniek. Meestal veroorzaakt het gebruik van water voor het wassen geen destructieve invloed op de bacteriën; er moet echter voorzichtig worden omgegaan en indien mogelijk moet de tijd van blootstelling aan water worden beperkt. Als het monstervoorbereidingsprotocol in het stadium van het wassen moet worden gepauzeerd, wordt aanbevolen om het monster in gepelletiseerde vorm te laten na het verwijderen van het water. Dit is met name van belang voor Gram-negatieve bacteriën, die een dunnere celwand bevatten omdat ze gevoeliger zijn voor scheuren.
Om te zorgen voor goede en hoogwaardige AFM-IR-gegevens zijn verschillende aspecten in het protocol voor gegevensverzameling van cruciaal belang. Ten eerste is het correct verzamelen van achtergrondinformatie essentieel voor data-acquisitie. In het bijzonder is het noodzakelijk om stabiele vochtigheidsniveaus te handhaven tijdens de achtergrondverzameling en tussen achtergrond- en monsterverzameling. Om dit te garanderen, raden we aan om het instrument te zuiveren met stikstof en de luchtvochtigheid niet hoger dan 25% te houden. Gebrek aan zuivering kan een aanzienlijke beperking opleggen, vooral op plaatsen met een hoge luchtvochtigheid. Ten tweede moet het belang van een goede optimalisatie van IR-spots worden benadrukt. Voor het beste resultaat kan a priori kennis over de positie van bandmaxima gunstig zijn. Een conventioneel IR-spectrum van bacteriële pellet kan bijvoorbeeld worden gebruikt om posities van banden te bepalen die van een monster worden verwacht. Als dat niet mogelijk is om te verkrijgen, kan de gebruiker als alternatieve benadering IR-spectra gebruiken die beschikbaar zijn in de literatuur of beginnen met de optimalisatie met behulp van een bandpositie die redelijk is om te verwachten in de bacterie (bijv. amide I en amide II). Ten derde is het voor het verzamelen van gegevens belangrijk om het belang van zorgvuldige vermogensselectie te benadrukken (waardoor een goede S / N-verhouding kan worden bereikt), omdat dit een destructief effect kan hebben. Het geadviseerde vermogen is afhankelijk van de dikte van het monster, met ruwe begeleiding beschikbaar in de instrumenthandleiding31. We raden aan om de toestand van het monster na de meting empirisch te testen door een AFM-afbeelding te verzamelen, omdat dit elke destructieve invloed zal onthullen. Verder dient het verzamelen van AFM-beelden uit hetzelfde gebied voor en na het verzamelen van AFM-IR spectra als een goede bevestiging dat er geen drift is opgetreden en de spectra inderdaad afkomstig zijn van het geselecteerde punt in de cel. De mogelijkheid van drift is vooral belangrijk bij het toepassen van de beeldvormingsmodaliteit, door middel van opeenvolgende beeldvorming van IR-intensiteit bij geselecteerde golfnummerwaarden. Een voorbeeld hiervan wordt geïllustreerd in figuur 5. Het afgebeelde gebied is aan het begin van het experiment gedefinieerd en is bedoeld om consistent te zijn voor alle golfnummerwaarden. Er is echter een duidelijke afwijking zichtbaar tussen elk AFM-hoogtebeeld (en de bijbehorende IR-golfnummerintensiteit), met een acquisitietijd van elke kaart van ongeveer 40 minuten. Daarom raden we gebruikers die beeldgegevens verzamelen aan om altijd een gebied te selecteren dat iets groter is dan het gewenste voorbeeld, om ervoor te zorgen dat zelfs bij het bestaan van drift het interessante monster binnen het afgebeelde gebied blijft.
De mogelijke beperkingen van het protocol omvatten het gebrek aan vermogen om gegevens in een gehydrateerde toestand te verzamelen in fysiologische oplossingen (bijv. Zoutoplossing of PBS) die hierboven zijn beschreven. Bovendien is er, vooral in gebieden met een hoge luchtvochtigheid, vaak behoefte aan stikstofzuivering. Bovendien maakt het protocol het mogelijk om organismen tot 100 nm groot te onderzoeken, met uitzondering van de mogelijkheid om het te gebruiken voor kleinere structuren. Hoewel dit kan worden ondervangen met behulp van een andere laser (bijvoorbeeld kwantumcascadelaser die de ruimtelijke resolutie van 20 nm kan bereiken), wordt het ook geassocieerd met een beperkt spectraal bereik en moeilijkheden bij het verkrijgen van een goede signaal-ruisverhouding. Ten slotte kan het tasten van zachte oppervlakken een uitdaging vormen waarbij de punt het oppervlak niet goed detecteert en voorbij het contactpunt gaat, totdat het breekt. Hoewel dit meestal geen probleem is met bacteriële monsters, kan het optreden bij metingen van zachtere monsters. In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om te proberen deel te nemen aan een schoon oppervlak van het substraat in de nabijheid van het monster.
Het beschreven protocol kan worden gebruikt voor tal van soorten bacterieel onderzoek, waaronder vergelijkende studies tussen verschillende monsters en subcellulair onderzoek. De gegevens kunnen worden geanalyseerd met behulp van chemometrische benaderingen voor enkelvoudige spectra en beeldvormingsmodaliteiten35, afhankelijk van het doel van het onderzoek. Bovendien kan het protocol ook worden aangepast voor toepassing op ander biologisch materiaal (zoals schimmels, gist, cellen, enz.), Door toevoeging van fixatie.
The authors have nothing to disclose.
We willen Bruker bedanken voor hun steun. Dit werk werd ondersteund door Monash University Advancing Women’s Success Grant (K. Kochan). A.Y.P erkent de steun van een Australian National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Dit werk werd gefinancierd door een Australian Research Council Discovery Project DP180103484. We willen de heer Finlay Shanks bedanken voor zijn instrumentale ondersteuning en mevrouw Xenia Kostoulias voor haar technische assistentie bij de monsters.
AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | 0 | model: nanoIR2 |
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | – | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | – | – |
Matlab | Mathworks Inc | – | Multivariate data analysis software |
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | – | – |
PLS toolbox | Mathworks Inc | – | GUI for Matlab |
Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
Selected bacterial strain | – | – | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | – |
Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | – |
Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | – |
Ultrapure water | – | – | – |