A Espectroscopia De Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) fornece uma plataforma poderosa para estudos bacterianos, permitindo alcançar a resolução de nanoescala. Ambos, o mapeamento de alterações subcelulares (por exemplo, na divisão celular) quanto estudos comparativos de composição química (por exemplo, decorrentes da resistência a medicamentos) podem ser conduzidos a um único nível celular em bactérias.
A Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) é uma nova técnica combinatória, que permite a caracterização simultânea de propriedades físicas e composição química da amostra com resolução nanoescala. Ao combinar AFM com IR, a limitação de resolução espacial do IR convencional é superada, permitindo que uma resolução de 20-100 nm seja alcançada. Isso abre as portas para uma ampla gama de novas aplicações de IR para sondar amostras menores que vários micrômetros, antes inalcançáveis por meio de microscopia de RI convencional. O AFM-IR é eminentemente adequado para pesquisas bacterianas, fornecendo informações espectrais e espaciais no nível único e intracelular. As crescentes preocupações globais com a saúde e a previsão futura desfavorável em relação às infecções bacterianas e, especialmente, ao rápido desenvolvimento da resistência antimicrobiana, criaram uma necessidade urgente de uma ferramenta de pesquisa capaz de sondar fenotípico no nível único celular e subcelular. A AFM-IR oferece o potencial de atender a essa necessidade, permitindo a caracterização detalhada da composição química de uma única bactéria. Aqui, fornecemos um protocolo completo para preparação amostral e aquisição de dados de espectro único e modalidade de mapeamento, para a aplicação do AFM-IR em estudos bacterianos.
Bactérias são organismos procarióticos de células únicas, ocorrendo em várias formas e tamanhos, tipicamente na faixa de várias centenas de nanômetros a micrômetros. Eles existem em uma variedade de habitats e são essenciais para a existência da vida. Dentro do corpo humano, a maioria das bactérias presentes no intestino são inofensivas e muitas são de fato benéficas1. No entanto, várias espécies bacterianas são patogênicas e causam uma série de doenças infecciosas. Infecções bacterianas podem levar ao desenvolvimento de sepse e choque séptico: uma condição de risco de vida, resultante da resposta do corpo a uma infecção2. A sepse é uma grande ameaça à saúde global, com alta prevalência mundial e taxas de mortalidade severas. Somente em 2017, foram registrados cerca de 50 milhões de casos de sepse em todo o mundo, com 11 milhões deles resultando em morte (aproximadamente 20%)2. Além disso, a diminuição das chances de sobrevivência do paciente, devido à demora terapêutica, mostrou-se ocorrer de forma horária3,4.
Infecções bacterianas são tratadas com antibióticos. A gravidade das consequências potenciais das infecções bacterianas da corrente sanguínea (ISS), juntamente com um claro significado do início rápido da terapia antimicrobiana, estimula a necessidade de administração imediata de antibióticos. No entanto, como as abordagens diagnósticas atuais utilizadas na prática clínica (por exemplo, cultivo de sangue) requerem um tempo relativamente longo, a administração de antibióticos geralmente ocorre antes do diagnóstico positivo do BSI5. Esse fator leva ao uso excessivo de antibióticos, o que, juntamente com o uso excessivo de antibióticos em outros setores, como a agricultura, cria uma severa pressão evolutiva para o desenvolvimento da resistência antimicrobiana (AMR)6,7. Atualmente, a AMR é um dos mais urgentes problemas globais de saúde7,8 e, até 2050, está prevista para se tornar a principal causa de morte9. O desenvolvimento da resistência, juntamente com a disseminação das cepas de AMR está ocorrendo em um ritmo alarmante7,8,9 e excede, de longe, a taxa de descoberta de novos antibióticos10. Novos fenótipos resistentes estão continuamente emergindo em todo o mundo, enquanto
pesquisa dedicada à compreensão das alterações relacionadas à RM é muitas vezes lenta e limitada pelas abordagens disponíveis11. Além disso, os métodos comumente utilizados, como a reação em cadeia de polimerase (PCR) e o sequenciamento genético inteiro (WGS), focam apenas em alterações genotipópicas. Estes não são suficientes para revelar os mecanismos de resistência11, o que provoca uma necessidade urgente de uma ferramenta de pesquisa que permita compreender a composição química das bactérias.
A espectroscopia infravermelha (IR) fornece uma caracterização molecular da amostra e, portanto, é um candidato promissor para sondagem bacteriana fenotípica. Desde suas primeiras aplicações12, uma grande magnitude de exemplos de seu uso foi demonstrada na literatura13,14. Estes incluem a identificação à base de bactérias emgêneros 15, espécies16e cepa17,18 nível. No entanto, a resolução espacial do IR convencional é restrita a vários mícrons devido ao limite de resolução espacial de difração de difração de comprimento de onda19. Uma vez que o tamanho da maioria das bactérias está abaixo desse limite (por exemplo, Staphylococcus aureus ≈ 400 nm de diâmetro), o IR convencional não é aplicável para sondagem no nível unicelular ou intracelular.
A limitação da resolução espacial foi recentemente superada pela combinação de espectroscopia de IR com Microscopia da Força Atômica (AFM-IR). Neste caso, a absorção do IR é detectada indiretamente, através da expansão térmica do material19,20,21,22. Em suma, a absorção da radiação IR resulta em um aumento de temperatura local. Isso pode ser medido diretamente23 ou através da medição da oscilação da sonda cantilever AFM, resultante do impulso de força criado pela absorção de IR20,21. A técnica combinatória AFM-IR permite alcançar uma resolução espacial de 20 nm, fornecendo informações simultâneas sobre as propriedades físicas locais de uma amostra (AFM) e sua composição química (AFM-IR). A coleta de ambos, espectro único de pontos selecionados e mapeamento da intensidade dos valores de número de ondas selecionados dentro de uma área escolhida são possíveis.
Considerando a resolução espacial alcançável do AFM-IR, é evidente que a técnica abre a possibilidade de sondagem química/fenotípica de célula única de bactéria e sua composição intracelular24. Até então, vários exemplos da aplicação de AFM-IR para bactérias únicas foram demonstrados na literatura19,20,21,22,25,26,27,28. Estes envolvem análise espectral única19,21,22 e mapeamento no nível subcelular19,22,25,26,27,28. Por exemplo, a capacidade de detectar vesículas lipídicas intracelulares27 e vírus28 dentro de uma única bactéria foi descrita. Esses resultados demonstram a utilidade do AFM-IR para estudos de nanoescala de bactérias únicas e patógenos clinicamente relevantes19.
Assim, apresentamos um método de preparação e coleta de amostras para dados AFM-IR de amostras bacterianas multicamadas, monocamadas e células únicas. O protocolo aqui descrito foi aplicado para estudar diferentes espécies de bactérias22 e as alterações em sua composição química. Em particular, o desenvolvimento in vivo da resistência à vancomicina e da suscetibilidade à daptomicina foi investigado em pares clínicos de S. aureus19. Ambos, a resistência intermitente vancomicina e a não suscetibilidade à daptomicina em S. aureus (VISA e DpR) surgiram relativamente recentemente, após o aumento do uso e introdução desses antibióticos às clínicas, constituindo um problema médico significativo. Além disso, em particular, o mecanismo de não suscetibilidade da daptomicina ainda permanece indescritível, impedindo o desenvolvimento de medicamentos alternativos19,29. O protocolo apresentado se concentra no fornecimento de espectros afm-IR confiáveis de bactérias únicas, que podem ser analisados ainda utilizando uma variedade de abordagens quimiómétricas, de acordo com os objetivos experimentais. Além disso, inclui a abordagem de mapeamento, que é aplicável para estudos intracelulares.
A utilidade da espectroscopia de RI para caracterização de uma ampla gama de amostras biológicas no contexto de sua composição química é bem estabelecida. Na última década, a espectroscopia de RI surgiu como uma ferramenta promissora para estudos bacterianos12,13,14,15,16,17. Continua a atrair interesse substancial no campo da microbiologia, como uma das poucas técnicas que permitem uma caracterização fenotípica através da composição química. Nesse contexto, a maior desvantagem da microscopia FTIR convencional está na resolução espacial limitada, prevenindo estudos unicelulares e subcelulares de bactérias. Na verdade, o pequeno tamanho das bactérias representa um impedimento não só para o IR, mas para a grande maioria das técnicas. Assim, as ferramentas de pesquisa disponíveis para estudos unicelulares e subcelulares de bactérias são significativamente limitadas. A combinação de AFM com IR permite que a limitação de resolução espacial da espectroscopia de RI seja superada, fornecendo uma nova ferramenta para a pesquisa bacteriana, capaz de sondar nanoescala da composição química.
A técnica não se limita a estudos de células únicas e permite sondar uma variedade de amostras, variando em espessura. Sem dúvida, a preparação de amostras limpas e cuidadosas é fundamental para alcançar imagens de alta qualidade. O protocolo aqui fornece um método para preparar amostras de multicamadas, monocamadas e/ou células únicas de várias bactérias(Figura 1). A amostra preparada depende de vários fatores, incluindo a carga bacteriana inicial, diluição pós-lavagem, bem como diluição adicional no substrato. A quantidade de amostra obtida após a diluição das pelotas lavadas e antes da deposição no substrato normalmente permite a preparação de inúmeras amostras. Portanto, para obter a distribuição desejada da amostra no substrato, muitas vezes é benéfico preparar uma série de amostras, variando em sua diluição. Para estudos que visam a coleta de espectros AFM-IR em vez de imagens subcelulares, modificar a quantidade de amostra (por exemplo, de monocamada para multicamadas) pode ser benéfico para aumentar a intensidade do sinal.
Outro aspecto crítico na preparação da amostra é a remoção adequada de resíduos médios. Dependendo dos métodos de cultivo de amostra selecionados, a amostra é coletada a partir do meio líquido ou de uma placa de ágar. Em ambos os casos, é provável que o residual médio esteja presente na amostra, embora em menor grau após a coleta de placas de ágar. Como as mídias de crescimento bacteriana contêm uma abundância de vários componentes biológicos, é fundamental garantir a remoção adequada do meio. Recomendamos três lavagens com água ultrauso para amostras de ágar e pelo menos quatro lavagens para amostras coletadas de médio porte. O número de lavagens pode ser aumentado, se necessário; no entanto, para comparação entre várias amostras, é importante mantê-la consistente entre as amostras. O protocolo demonstrado utiliza água, em vez de solventes como solução tampão fosfato (PBS) ou soro fisiológico. Tanto a PBS quanto a solução salina levam à formação de cristais na secagem do ar, o que pode danificar as bactérias. Além disso, ambas são fonte de intensas bandas de IR, com PBS, em particular, contendo múltiplas bandas na região das impressões digitais. A falta de capacidade para o uso de soro fisiológico ou PBS, atualmente representa uma limitação importante para a técnica. Normalmente, o uso de água para lavagem não causa qualquer influência destrutiva sobre as bactérias; no entanto, deve-se tomar cuidado e, se possível, o tempo de exposição à água deve ser limitado. Se o protocolo de preparação da amostra precisar ser pausado na fase de lavagem, recomenda-se deixar a amostra em forma pelletizada após a remoção da água. Isso é de particular importância para as bactérias Gram-negativas, contendo uma parede celular mais fina, pois elas são mais propensas à ruptura.
Para garantir dados AFM-IR adequados e de alta qualidade, vários aspectos do protocolo de coleta de dados são de fundamental importância. Em primeiro lugar, a coleta correta de fundo é essencial para a aquisição de dados. Em particular, é necessária a manutenção dos níveis estáveis de umidade em todo o conjunto de dados, bem como entre o fundo e a coleta de amostras. Para garantir isso, recomendamos a purga do instrumento com nitrogênio e a manutenção dos níveis de umidade não superiores a 25%. A falta de purga pode impor uma limitação significativa, particularmente em locais com alta umidade. Em segundo lugar, destaca-se a importância da otimização adequada das manchas de IR. Para obter melhores resultados, o conhecimento a priori sobre a posição da banda maxima pode ser benéfico. Por exemplo, um espectro de IR convencional de pelotas bacterianas pode ser usado para determinar posições de bandas esperadas a partir de uma amostra. Se isso não for possível adquirir, como abordagem alternativa, o usuário pode utilizar espectros de RI disponíveis na literatura ou iniciar a otimização usando uma posição de banda que é razoável esperar na bactéria (por exemplo, amide I e amide II). Em terceiro lugar, para a coleta de dados, é importante destacar a significância da seleção cuidadosa de energia (permitindo alcançar uma boa relação S/N), pois pode ter um efeito destrutivo. O poder aconselhado depende da espessura da amostra, com orientação áspera disponível no manual do instrumento31. Recomendamos testar empiricamente o estado da amostra pós-medição por coleta de uma imagem AFM, pois revelará qualquer influência destrutiva. Além disso, a coleta de imagens AFM da mesma área antes e depois da coleta de espectros AFM-IR serve como uma boa confirmação de que não ocorreu nenhuma deriva e o espectro de fato se origina do ponto selecionado na célula. A possibilidade de deriva é particularmente importante na aplicação da modalidade de imagem, por meio de imagens consecutivas de intensidade de IR em valores de número de ondas selecionados. Um exemplo disso é ilustrado na Figura 5. A área imagem foi definida no início do experimento e deve ser consistente para todos os valores do número de ondas. No entanto, uma deriva clara é visível entre cada imagem de altura AFM (e a intensidade de número de onda ir correspondente), com tempo de aquisição de cada mapa de aproximadamente 40 minutos. Devido a isso, para usuários que coletam dados de imagem, recomendamos sempre selecionar uma área ligeiramente maior que a amostra de interesse, para garantir que, mesmo após a existência de deriva, a amostra de interesse permanecerá dentro da área de imagem.
As limitações potenciais do protocolo incluem a falta de capacidade de coleta de dados em estado hidratado em soluções fisiológicas (por exemplo, soro fisiológico ou PBS) descritas acima. Além disso, especialmente em áreas de alta umidade, muitas vezes há necessidade de expurgo de nitrogênio. Além disso, o protocolo permite sondar organismos até 100 nm de tamanho, excluindo a possibilidade de seu uso para estruturas menores. Embora isso possa ser superado usando um laser diferente (por exemplo, laser em cascata quântica permitindo alcançar a resolução espacial de 20 nm), ele também está associado com alcance espectral limitado, bem como dificuldades em obter uma boa relação sinal-ruído. Finalmente, a sondagem de superfícies macias pode apresentar um desafio com a ponta não detectando a superfície corretamente e procedendo além do ponto de contato, até a quebra. Embora isso normalmente não seja um problema com amostras bacterianas, pode ocorrer após medições de amostras mais suaves. Nesses casos, recomenda-se tentar se engajar na superfície limpa do substrato nas proximidades da amostra.
O protocolo descrito pode ser utilizado para inúmeros tipos de pesquisas bacterianas, incluindo estudos comparativos entre várias amostras, bem como exame subcelular. Os dados podem ser analisados utilizando abordagens quimiómétricas para as modalidades de espectro único e imagem35,dependendo do objetivo da pesquisa. Além disso, o protocolo também pode ser modificado para aplicação a outros materiais biológicos (como fungos, leveduras, células, etc.), através da adição de fixação.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de reconhecer Bruker pelo apoio deles. Este trabalho foi apoiado pela Monash University Advanceing Women’s Success Grant (K. Kochan). A A.Y.P reconhece o apoio de uma Bolsa australiana do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (APP1117940). Este trabalho foi financiado por um Projeto de Descoberta do Conselho de Pesquisa Australiano DP180103484. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Finlay Shanks por seu apoio instrumental e à Sra. Xenia Kostoulias por sua assistência técnica com as amostras.
AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | 0 | model: nanoIR2 |
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | – | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | – | – |
Matlab | Mathworks Inc | – | Multivariate data analysis software |
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | – | – |
PLS toolbox | Mathworks Inc | – | GUI for Matlab |
Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
Selected bacterial strain | – | – | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | – |
Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | – |
Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | – |
Ultrapure water | – | – | – |