Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) fornisce una potente piattaforma per studi batterici, consentendo di raggiungere una risoluzione su scala nanometrica. Sia la mappatura dei cambiamenti subcellulari (ad esempio, sulla divisione cellulare) che gli studi comparativi della composizione chimica (ad esempio, derivanti dalla resistenza ai farmaci) possono essere condotti a livello di singola cellula nei batteri.
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) è una nuova tecnica combinatoria, che consente la caratterizzazione simultanea delle proprietà fisiche e della composizione chimica del campione con risoluzione su scala nanometrica. Combinando AFM con IR, viene superata la limitazione della risoluzione spaziale dell’IR convenzionale, consentendo di raggiungere una risoluzione di 20-100 nm. Ciò apre la porta a una vasta gamma di nuove applicazioni dell’IR verso il sondaggio di campioni più piccoli di diversi micrometri, precedentemente irraggiungibili mediante la microscopia IR convenzionale. AFM-IR è eminentemente adatto per la ricerca batterica, fornendo informazioni sia spettrali che spaziali a livello di singola cellula e intracellulare. Le crescenti preoccupazioni per la salute globale e le previsioni future sfavorevoli riguardanti le infezioni batteriche e, in particolare, il rapido sviluppo della resistenza antimicrobica, hanno creato un urgente bisogno di uno strumento di ricerca in grado di sondare fenotipicamente a livello di singola cellula e subcellulare. AFM-IR offre il potenziale per rispondere a questa esigenza, consentendo la caratterizzazione dettagliata della composizione chimica di un singolo batterio. Qui forniamo un protocollo completo per la preparazione del campione e l’acquisizione dei dati dei singoli spettri e la modalità di mappatura, per l’applicazione di AFM-IR verso studi batterici.
I batteri sono organismi procariotici a singola cellula, che si verificano in varie forme e dimensioni, in genere nell’intervallo da diverse centinaia di nanometri a micrometri. Esistono in una varietà di habitat e sono essenziali per l’esistenza della vita. All’interno del corpo umano, la maggior parte dei batteri presenti nell’intestino sono innocui e molti sono infatti benefici1. Tuttavia, diverse specie batteriche sono patogene e causano una serie di malattie infettive. Le infezioni batteriche possono portare allo sviluppo di sepsi e shock settico: una condizione pericolosa per la vita, derivante dalla risposta del corpo a un’infezione2. La sepsi è una grave minaccia per la salute globale, con un’alta prevalenza in tutto il mondo e gravi tassi di mortalità. Solo nel 2017, circa 50 milioni di casi di sepsi sono stati registrati in tutto il mondo, con 11 milioni di quelli che hanno provocato la morte (circa il 20%)2. Inoltre, una diminuzione delle possibilità di sopravvivenza del paziente, a causa del ritardo della terapia, ha dimostrato di verificarsi in modo orario3,4.
Le infezioni batteriche sono trattate con antibiotici. La gravità delle potenziali conseguenze delle infezioni batteriche del flusso sanguigno (BSI), insieme a un chiaro significato di un rapido inizio della terapia antimicrobica, richiedono la necessità di una somministrazione immediata di antibiotici. Tuttavia, poiché gli attuali approcci diagnostici utilizzati nella pratica clinica (ad esempio, la coltura del sangue) richiedono un tempo relativamente lungo, la somministrazione di antibiotici avviene spesso prima della diagnosi di BSI positiva5. Questo fattore porta a un ampio uso eccessivo di antibiotici, che – insieme all’uso eccessivo di antibiotici in altri settori come l’agricoltura – crea una forte pressione evolutiva verso lo sviluppo della resistenza antimicrobica (AMR)6,7. La resistenza antimicrobica è attualmente uno dei problemi di salute globale piùurgenti 7,8 e, entro il 2050, si prevede che diventerà la principale causa di morte9. Lo sviluppo della resistenza, insieme alla diffusione dei ceppi di AMR si sta verificando ad un ritmo allarmante7,8,9 e supera, di gran lunga, il tasso di scoperta di nuovi antibiotici10. Nuovi fenotipi resistenti emergono continuamente in tutto il mondo, mentre
la ricerca dedicata alla comprensione dei cambiamenti correlati alla resistenza antimicrobica è spesso lenta e limitata dagli approcci disponibili11. Inoltre, i metodi comunemente usati, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) e il sequenziamento dell’intero gene (WGS), si concentrano solo sui cambiamenti genotipici. Questi non sono sufficienti a rivelare i meccanismi di resistenza11, spingendo un urgente bisogno di uno strumento di ricerca che consenta di comprendere la composizione chimica dei batteri.
La spettroscopia infrarossa (IR) fornisce una caratterizzazione molecolare del campione ed è quindi un candidato promettente per il sondaggio batterico fenotipico. Fin dalle sue prime applicazioni12, una grande grandezza di esempi del suo uso è stata dimostrata nella letteratura13,14. Questi includono l’identificazione fenotipica dei batteri sul genere15,specie16e ceppo17,livello 18. Tuttavia, la risoluzione spaziale dell’IR convenzionale è limitata a diversi micron a causa del limite di risoluzione spaziale di diffrazione della lunghezza d’onda19. Poiché la dimensione della maggior parte dei batteri si trova al di sotto di tale limite (ad esempio, Staphylococcus aureus ≈ 400 nm di diametro), l’IR convenzionale non è applicabile per il sondaggio a livello a cellula singola o intracellulare.
La limitazione della risoluzione spaziale è stata recentemente superata combinando la spettroscopia IR con la microscopia a forza atomica (AFM-IR). In questo caso, l’assorbimento IR viene rilevato indirettamente, attraverso l’espansione termica del materiale19,20,21,22. In breve, l’assorbimento della radiazione IR si traduce in un aumento della temperatura locale. Questo può essere misurato sia direttamente23 che attraverso la misurazione dell’oscillazione della sonda a sbalzo AFM, risultante dall’impulso di forza creato dall’assorbimento IR20,21. La tecnica combinatoria AFM-IR consente di raggiungere una risoluzione spaziale che si avvicina ai 20 nm, fornendo informazioni simultanee sulle proprietà fisiche locali di un campione (AFM) e sulla sua composizione chimica (AFM-IR). Sono possibili la raccolta di entrambi, singoli spettri da punti selezionati e la mappatura dell’intensità dei valori di numero d’onda selezionati all’interno di un’area scelta.
Considerando la risoluzione spaziale raggiungibile di AFM-IR, è evidente che la tecnica apre la possibilità di sondare chimicamente/fenotipicamente singole cellule batteriche e la loro composizione intracellulare24. Finora, diversi esempi dell’applicazione di AFM-IR per singoli batteri sono stati dimostrati in letteratura19,20,21,22,25,26,27,28. Questi coinvolgono l’analisi spettrale singola19,21,22 e la mappatura a livello subcellulare19,22,25,26,27,28. Ad esempio, è stata descritta la capacità di rilevare le vescicole lipidiche intracellulari27 e i virus28 all’interno di un singolo batterio. Questi risultati dimostrano l’utilità di AFM-IR per studi su scala nanometrica di singoli batteri e patogeni clinicamente rilevanti19.
Quindi, presentiamo un metodo di preparazione e raccolta del campione per i dati AFM-IR di campioni batterici multistrato, monostrato e monocellulare. Il protocollo qui descritto è stato applicato per studiare diverse specie di batteri22 e i cambiamenti nella loro composizione chimica. In particolare, lo sviluppo in vivo della resistenza alla vancomicina e della non suscettibilità alla daptomicina è stato studiato in coppie cliniche di S. aureus19. Sia la resistenza intermittente alla vancomicina che la non suscettibilità alla daptomicina in S. aureus (VISA e DpR) sono emerse relativamente di recente, a seguito dell’aumento dell’uso e dell’introduzione di questi antibiotici nelle cliniche, costituendo un problema medico significativo. Inoltre, in particolare, il meccanismo di non suscettibilità alla daptomicina rimane ancora sfuggente, ostacolando lo sviluppo di farmaci alternativi19,29. Il protocollo presentato si concentra sulla fornitura di spettri AFM-IR affidabili di singoli batteri, che possono essere ulteriormente analizzati utilizzando una varietà di approcci chemiometrici, secondo gli obiettivi sperimentali. Include inoltre l’approccio di mappatura, che è applicabile per gli studi intracellulari.
L’utilità della spettroscopia IR per la caratterizzazione di una vasta gamma di campioni biologici nel contesto della loro composizione chimica è ben consolidata. Negli ultimi dieci anni, la spettroscopia IR è emersa come uno strumento promettente per gli studi batterici12,13,14,15,16,17. Continua ad attirare un notevole interesse nel campo della microbiologia, come una delle poche tecniche che consentono una caratterizzazione fenotipica attraverso la composizione chimica. In questo contesto, il principale svantaggio della microscopia FTIR convenzionale risiede nella limitata risoluzione spaziale, impedendo studi su singole cellule e subcellulari sui batteri. In effetti, le piccole dimensioni dei batteri rappresentano un impedimento non solo per l’IR, ma per la stragrande maggioranza delle tecniche. Pertanto, gli strumenti di ricerca disponibili per gli studi su singole cellule e subcellulari sui batteri sono significativamente limitati. La combinazione di AFM con IR consente di superare la limitazione della risoluzione spaziale della spettroscopia IR, fornendo un nuovo strumento per la ricerca batterica, in grado di sondare su scala nanometrica la composizione chimica.
La tecnica non si limita agli studi su singole cellule e consente di sondare una varietà di campioni, di spessore vario. Indubbiamente, una preparazione del campione pulita e attenta è fondamentale per ottenere immagini di alta qualità. Il protocollo qui fornito fornisce un metodo per preparare campioni multistrato, monostrato e/o a singola cellula di vari batteri (Figura 1). Il campione preparato dipende da diversi fattori, tra cui la carica batterica iniziale, la diluizione post-lavaggio e un’ulteriore diluizione sul substrato. La quantità di campione ottenuta dopo aver diluito il pellet lavato e prima della deposizione sul substrato consente tipicamente la preparazione di numerosi campioni. Pertanto, per ottenere la distribuzione desiderata del campione sul substrato, è spesso utile preparare una serie di campioni, che vanno nella loro diluizione. Per gli studi finalizzati alla raccolta di spettri AFM-IR piuttosto che all’imaging subcellulare, modificare la quantità di campione (ad esempio, da monostrato a multistrato) può essere utile per aumentare l’intensità del segnale.
Un altro aspetto critico nella preparazione del campione è l’appropriata rimozione dei residui medi. A seconda dei metodi di coltivazione del campione selezionati, il campione viene raccolto da un mezzo liquido o da una piastra di agar. In entrambi i casi, è probabile che il residuo medio sia presente nel campione, anche se in misura molto minore al momento della raccolta da piastre di agar. Poiché i mezzi di crescita batterica contengono un’abbondanza di vari componenti biologici, è fondamentale garantire un’adeguata rimozione del mezzo. Raccomandiamo tre lavaggi con acqua ultrapura per i campioni di piastre di agar e almeno quattro lavaggi per i campioni raccolti dal mezzo. Il numero di lavaggi può essere aumentato, se necessario; tuttavia, per il confronto tra vari campioni, è importante mantenerlo coerente tra i campioni. Il protocollo dimostrato utilizza acqua, piuttosto che solventi come la soluzione tampone fosfato (PBS) o la soluzione salina. Sia pbS che soluzione salina portano alla formazione di cristalli dopo l’essiccazione all’aria, che può danneggiare i batteri. Inoltre, entrambi sono una fonte di bande IR intense, con PBS, in particolare, contenente più bande nella regione delle impronte digitali. La mancanza di capacità per l’uso di soluzione salina o PBS, rappresenta attualmente un limite importante per la tecnica. Tipicamente, l’uso di acqua per il lavaggio non causa alcuna influenza distruttiva sui batteri; tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione e, se possibile, il tempo di esposizione all’acqua dovrebbe essere limitato. Se il protocollo di preparazione del campione deve essere messo in pausa nella fase di lavaggio, si consiglia di lasciare il campione in forma pellettizzata dopo aver rimosso l’acqua. Questo è di particolare importanza per i batteri Gram-negativi, contenenti una parete cellulare più sottile in quanto sono più inclini alla rottura.
Per garantire dati AFM-IR adeguati e di alta qualità, diversi aspetti del protocollo di raccolta dati sono di fondamentale importanza. In primo luogo, la corretta raccolta dello sfondo è essenziale per l’acquisizione dei dati. In particolare, è necessario il mantenimento di livelli di umidità stabili durante tutta la raccolta dello sfondo e tra la raccolta dello sfondo e del campione. Per garantire ciò, si consiglia di spurgare lo strumento con azoto e mantenere i livelli di umidità non superiori al 25%. La mancanza di spurgo può imporre una limitazione significativa, in particolare in luoghi con elevata umidità. In secondo luogo, dovrebbe essere evidenziata l’importanza di una corretta ottimizzazione dei punti IR. Per ottenere i migliori risultati, la conoscenza a priori della posizione dei massimi di banda può essere utile. Ad esempio, uno spettro IR convenzionale di pellet batterico può essere utilizzato per determinare le posizioni delle bande attese da un campione. Se ciò non è possibile acquisire, come approccio alternativo, l’utente può utilizzare gli spettri IR disponibili in letteratura o iniziare l’ottimizzazione utilizzando una posizione di banda che è ragionevole aspettarsi nel batterio (ad esempio, ammide I e ammide II). In terzo luogo, per la raccolta dei dati, è importante sottolineare l’importanza di un’attenta selezione della potenza (che consente di ottenere un buon rapporto S / N), in quanto può avere un effetto distruttivo. La potenza consigliata dipende dallo spessore del campione, con guida approssimativa disponibile nel manuale dello strumento31. Raccomandiamo di testare empiricamente lo stato del campione post-misurazione mediante la raccolta di un’immagine AFM, in quanto rivelerà qualsiasi influenza distruttiva. Inoltre, la raccolta di immagini AFM dalla stessa area prima e dopo la raccolta di spettri AFM-IR serve come una buona conferma che non si è verificata alcuna deriva e che gli spettri provengono effettivamente dal punto selezionato nella cellula. La possibilità di deriva è particolarmente importante quando si applica la modalità di imaging, attraverso l’imaging consecutivo dell’intensità IR a valori di numero d’onda selezionati. Un esempio di questo è illustrato nella Figura 5. L’area definita all’inizio dell’esperimento è stata definita ed è pensata per essere coerente per tutti i valori del numero d’onda. Tuttavia, è visibile una chiara deriva tra ogni immagine di altezza AFM (e l’intensità del numero d’onda IR corrispondente), con un tempo di acquisizione di ciascuna mappa di circa 40 minuti. Per questo ciò, per gli utenti che raccolgono dati di imaging, si consiglia di selezionare sempre un’area leggermente più grande del campione di interesse, per garantire che anche in caso di esistenza di deriva, il campione di interesse rimanga all’interno dell’area stessa.
I potenziali limiti del protocollo includono la mancanza di capacità di raccogliere dati in uno stato idratato nelle soluzioni fisiologiche (ad esempio, soluzione salina o PBS) sopra descritte. Inoltre, soprattutto nelle aree ad alta umidità, c’è spesso bisogno di spurgo dell’azoto. Inoltre, il protocollo consente di sondare organismi fino a 100 nm di dimensione, escludendo la possibilità del suo utilizzo per strutture più piccole. Sebbene questo possa essere superato utilizzando un laser diverso (ad esempio, laser a cascata quantistica che consente di raggiungere la risoluzione spaziale di 20 nm), è anche associato a una gamma spettrale limitata e alle difficoltà nell’ottenere un buon rapporto segnale / rumore. Infine, il sondaggio di superfici morbide può rappresentare una sfida con la punta che non rileva correttamente la superficie e procede oltre il punto di contatto, fino alla rottura. Anche se questo in genere non è un problema con i campioni batterici, può verificarsi su misurazioni di campioni più morbidi. In questi casi, si consiglia di tentare di impegnarsi sulla superficie pulita del substrato in prossimità del campione.
Il protocollo descritto può essere utilizzato per numerosi tipi di ricerca batterica, compresi studi comparativi tra vari campioni e l’esame subcellulare. I dati possono essere analizzati utilizzando approcci chemiometrici per singoli spettri e modalità di imaging35, a seconda dello scopo della ricerca. Inoltre, il protocollo può anche essere modificato per l’applicazione ad altro materiale biologico (come funghi, lieviti, cellule, ecc.), attraverso l’aggiunta di fissazione.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Bruker per il loro sostegno. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Monash University Advancing Women’s Success Grant (K. Kochan). A.Y.P riconosce il sostegno di una borsa di studio del National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Questo lavoro è stato finanziato da un Australian Research Council Discovery Project DP180103484. Vorremmo ringraziare il signor Finlay Shanks per il suo supporto strumentale e la signora Xenia Kostoulias per la sua assistenza tecnica con i campioni.
AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | 0 | model: nanoIR2 |
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | – | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | – | – |
Matlab | Mathworks Inc | – | Multivariate data analysis software |
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | – | – |
PLS toolbox | Mathworks Inc | – | GUI for Matlab |
Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
Selected bacterial strain | – | – | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | – |
Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | – |
Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | – |
Ultrapure water | – | – | – |