Akut mushjärnslicing för att undersöka spontan hippocampal nätverksaktivitet

Elektrofysiologisk mätning från levande hippocampala skivor in vitro är ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt med många fördelar. Experimenteraren kan använda ett mikroskop, mikromanipulatorer och ett inspelningssystem för att direkt visualisera och samla mätningar från enskilda nervceller i vävnaden. Vävnadsskivor är också mycket tillgängliga för fotostimulering eller läkemedelsleverans för optogenetiska, chemogenetiska eller farmakologiska experiment.

Hippocampal nätverket genererar mycket synkron befolkning aktivitet in vivo, synlig som svängningar i det extracellulära lokala fältet potential^1,2,3,4,5. Brain slice metoder har utnyttjats för att få insikt i cellulära och krets mekanismer som ligger till grund för dessa neuronala nätverk svängningar. Grundläggande arbete från Maier et al. visade att skarpa våg-ripple komplex (SWRs) kan dyka upp spontant i skivor av ventral hippocampus^6,7. Efterföljande studier från flera utredare har gradvis klarlagt många aspekter av SWR, inklusive neuromodulatorernas roll i att reglera nätverkstillståndet för hippocampus^8,9,10 och de synaptiska mekanismerna som driver in vitro-återaktivering av neuronala ensembler som tidigare var aktiva under beteende in vivo¹¹. Hjärnsegmentexperiment har också gett insikt i gammaområdets svängning (30–100 Hz), ett distinkt hippocampalt nätverkstillstånd som tros stödja minneskodning och^{återkalla 12,13}. Slutligen, erkänner hippocampus centrala roll och associerade strukturer i patofysiologin för temporal lob epilepsi^14,15, forskare har använt hippocampal slice preparat för att undersöka generering och spridning av epileptiform aktivitet. Carter et al. visat att kombinerade hippocampal-entorhinal cortex skivor beredda från kroniskt epileptiska djur kan spontant generera epileptiform utsläpp in vitro¹⁶. Därefter undersökte Karlócai et al. mekanismerna bakom epileptiforma utsläpp i hippocampal skivor med hjälp av modifierad konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) med ändrade jonkoncentrationer (minskad Mg^{2 + eller} förhöjd K⁺) eller tillsatta läkemedel (4AP eller gabazin)¹⁷.

Utredare har utvecklat många hippocampal slice metoder som skiljer sig åt på viktiga sätt: (1) regionen hippocampus som finns i skivan (dorsala, mellanliggande eller ventrala); (2) Förekomst eller frånvaro av extrahippocampala vävnader såsom entorhinal cortex. (3) Den orientering som används för att skära skivor (koronal, sagittal, horisontell eller sned); och (4) de förhållanden under vilka vävnaden bibehålls efter skivning (helt nedsänkt i ACSF eller hålls i gränslandet mellan ACSF och fuktad, karbinrik luft).

Valet av vilken skivningsstrategi som ska användas bör bestämmas av försöksmålet. Till exempel har tvärgående eller koronala skivor av dorsala hippocampus som upprätthålls under nedsänkta förhållanden använts mycket effektivt för undersökning av intrahippocampalkretsar och synaptisk plasticitet^18,19,20. Sådana preparat genererar dock inte spontant nätverksoscillationer lika lätt som skivor från ventral hippocampus^21,22,23. Även om ett tillstånd av ihållande SWR-aktivitet kan induceras av ttanisk stimulering i tvärgående skivor från dorsala och ventrala hippocampus²⁴, observeras spontana SWR lättare i ventrala^{skivor 7,25}.

En inneboende fysiologisk och anatomisk skillnad mellan dorsala och ventrala hippocampus stöds av studier som utförs både in vivo och in vitro²⁶. Inspelningar hos råttor visade starkt sammanhängande theta rytmer i hela dorsala och mellanliggande hippocampus, men dålig sammanhållning mellan ventral regionen och resten av hippocampus²⁷. STÅL in vivo förökar sig lätt mellan dorsala och mellanliggande hippocampus, medan SWR som har sitt ursprung i ventral hippocampus ofta förblir lokala²⁸. De associationsprojektioner som härrör från CA3 pyramidala nervceller som bor i dorsala och mellanliggande hippocampus projektet långa avstånd längs hippocampus längs längsgående axeln. CA3-prognoser från ventrala regioner är fortfarande relativt lokala och är därför mindre benägna att skäras av under skivningsprocessen^29,30. Ventrala skivor kan därför bättre bevara det återkommande nätverk som krävs för att generera befolkningssynkronisering. Benägenheten hos ventrala skivor att generera spontana nätverksaktiviteter in vitro kan också återspegla högre inneboende excitabilitet av pyramidala nervceller eller svagare GABAergic hämning i ventrala hippocampus jämfört med mer dorsala regioner³¹. Faktum är att ventrala hippocampal skivor är mer mottagliga för epileptiform aktivitet^32,33. Således har många studier av spontana^{fysiologiska 8,9,11,24} eller patologiska^16,34,35,36 nätverkssvängningar traditionellt använt en horisontell skivning, ibland med en liten vinkel i fronto-occipital riktningen, vilket ger vävnadsskivor parallellt med ventrala hippocampus tvärplan.

Nätverksanslutningen påverkas oundvikligen av skivningsproceduren eftersom många celler i segmentet kommer att skäras av. Vinkeln och tjockleken på skivan och vävnaden som behålls i preparatet bör övervägas för att optimera anslutningen i kretsarna av intresse. Många studier har använt horisontella kombinerade hippocampal-entorhinal cortex skivor (HEC) för att utforska interaktioner mellan de två strukturerna i samband med fysiologiska eller patologiska nätverk svängningar. Roth et al. utförde dubbla inspelningar från CA1-delfältet i hippocampus och lager V av den mediala entorhinala cortex för att demonstrera spridning av SWR-aktivitet genom HEC-skivan³⁷. Många studier av epileptiform aktivitet har använt HEC skiva förberedelse för att undersöka hur epileptiform utsläpp sprider sig genom corticohippocampal nätverk^16,35,36,38. Det är viktigt att notera att bevarandet av den intakta corticohippocampal slingan inte är en förutsättning för spontana SWRs, epileptiform urladdningar eller gamma svängningar. nätverkssvängningar kan genereras i tvärgående skivor av dorsala eller ventrala hippocampus utan bifogade parahippocampal^{vävnader 21,22,23, 25,39,40,41}. En viktigare faktor för den spontana generationen av nätverkssvängningar i hippocampal skivor kan vara tjockleken på varje skiva, eftersom en tjockare skiva (400-550 μm) kommer att bevara mer anslutning i CA2 / CA3 återkommande nätverk^21,22,25.

Även om vinklade horisontella HEC-skivor (skurna med en cirka 12° vinkel i fronto-occipital riktning) har använts för att studera den funktionella anslutningen av corticohippocampal^{slingan 11,16,34,35,42}, krävs sådana vinklade preparat inte för spontan^{nätverksaktivitet 43,44,45}. Användningen av ett vinklat skivplan gör det dock möjligt för prövaren att selektivt göra skivor som bäst bevarar de tvärgående orienterade lamellerna i antingen ventrala eller mellanliggande hippocampus, beroende på om en nedåt- eller uppåtriktad vinkel appliceras (figur 1). Detta tillvägagångssätt är konceptuellt likt det som används av Papatheodoropoulos et al., 2002, som dissekerade varje hippocampusfri och sedan använde en vävnadshacker för att skapa tvärgående skivor längs hela dorsala-ventrala axeln²¹. Mot bakgrund av de ovannämnda funktionella skillnaderna mellan ventrala och dorsala-mellanliggande hippocampus, bör utredare överväga anatomiska ursprunget för skivor när man utformar experiment eller tolkar resultat. Att använda en agarramp under skivningsproceduren är ett enkelt sätt att företrädesvis producera skivor från antingen mellanliggande eller ventral hippocampus.

Hippocampalskivor kan bibehållas i antingen en nedsänkt kammare (med vävnaden helt nedsänkt i ACSF) eller en kammare i gränssnittsstil (t.ex. Oslo eller Haas kammare, med skivor som endast täcks av en tunn film av flödande media). Gränssnittsunderhåll förbättrar syresättningen av vävnaden, vilket främjar neuronal överlevnad och möjliggör ihållande höga nivåer av interneuronal aktivitet. Traditionellt använder nedsänkta inspelningsförhållanden ett långsammare ACSF-flöde som inte ger tillräcklig vävnadssyresättning för stabilt uttryck av svängningar på nätverksnivå. I nedsänkta hippocampal skivor observeras carbachol-inducerad gamma oscillations endast^{övergående 46,47}, medan de kan hållas stabilt i gränssnitt inspelningskammare^10,48,49. Som sådan har många studier av komplex spontan aktivitet in vitro förlitat sig på gränssnitt inspelningskammare för att undersöka skarpa våg krusning komplex^{6,7,8,9,10,25,37}, gamma svängningar^10,13, och epileptiform aktivitet^16,38,45,47.

I en inspelningskammare i nedsänkt stil kan ett nedsänkningsmikroskopmål användas för att visualisera enskilda celler och selektivt rikta in sig på friska celler för inspelningar. Den nedsänkta beredningen möjliggör också fin kontroll över cellmiljön, eftersom nedsänkning underlättar snabb diffusion av droger eller andra föreningar till vävnaden. Således utgör en modifierad metod där stabila nätverkssvängningar upprätthålls under nedsänkta förhållanden ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt. Detta tillvägagångssätt exemplifieras av arbetet i Hájos et al., där hippocampal skivor återhämtar sig i en förenklad gränssnittsliknande hållkammare i flera timmar innan de överförs till en modifierad nedsänkt inspelningskammare med ett högt flöde av ACSF (~ 6 ml / min) för att förbättra syretillförseln^{till vävnaden 12,48,49}. Under dessa förhållanden kan höga nivåer av interneuron aktivitet och stabila spontana nätverk svängningar upprätthållas i en nedsänkt inspelningskammare. Detta modifierade tillvägagångssätt gör det möjligt för utredarna att utföra visuellt guidade hela cell patch clamp inspelningar och karakterisera bidraget från morfologiskt identifierade celltyper till carbachol-inducerad gamma svängningar¹². SWR kan också uppstå spontant i nedsänkta hippocampal skivor med en snabb flödeshastighet av ACSF^11,48,49. Maier et al. visade att hippocampala skivor som återhämtade sig i en gränssnittskammare innan de överfördes till en nedsänkt inspelningskammare på ett tillförlitligt sätt uppvisade spontana SWR, medan skivor som återhämtade sig nedsänkta i en bägare före överföring till en nedsänkt inspelningskammare visade mindre framkallade fältsvar, lägre nivåer av spontana synaptiska strömmar och endast mycket sällan uppvisade spontana SWRs⁴³. Schlingloff et al. använde denna förbättrade metodik för att demonstrera rollen av parvalbumin-uttrycka korgceller i genereringen av spontana SWRs⁴⁴.

Följande protokoll presenterar en skivningsmetod genom vilken spontant aktiva nervceller i horisontella hippocampal skivor kan återvinnas under gränssnittsförhållanden och därefter upprätthållas i en nedsänkt inspelningskammare lämplig för farmakologiska eller optogenetiska manipuleringar och visuellt guidade inspelningar.