급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

체외에서 살아있는 해마 슬라이스에서 전기 생리학적 측정은 수많은 장점을 가진 강력한 실험 적 접근 방식입니다. 실험자는 현미경, 미세 조작기 및 기록 시스템을 사용하여 조직의 개별 뉴런에서 측정을 직접 시각화하고 수집할 수 있습니다. 조직 조각은 또한 광유전학, 화학유전학, 또는 약리학 실험을 위한 사진 자극 또는 약 전달에 아주 접근합니다.

해마 네트워크는 생체 내에서매우 동기적인 인구 활성을 생성하며, 세포외 지역 필드 전위^1,2,3,4,5에서 진동으로 볼 수^있다. 뇌 슬라이스 방법은 이러한 신경 네트워크 진동의 기초 세포 및 회로 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 활용되었습니다. 마이어 외(Maier) 등의 기초 작업은 날카로운 파리플 복합체(SWRs)가 복부 해마^6,7의슬라이스에서 자발적으로 나타날 수 있음을 입증하였다. 여러조사자로부터의 후속 연구는 점차 해마^8,9,10의 네트워크 상태를 조절하는 신경 조절기의 역할을 포함하여 SRS의 많은 측면을 점진적으로 해명하고 생체 내에서 동작 중에 이전에 활성화된 신경 앙상블의 체외 재활성화를 유도하는 시냅스^{메커니즘을} 유도한다. 뇌 슬라이스 실험은 또한 감마 범위 진동 (30-100 Hz)에 대한 통찰력을 제공했으며, 메모리 인코딩을 지원하고^12,13을리콜하는 것으로 추정되는 독특한 해마 네트워크 상태. 마지막으로, 측두엽 간질의 병리생리학에서 해마및 관련 구조물의 중심적인 역할을 인식하여^14,15,연구원은 간질 활성의 생성 및 전파를 조사하기 위하여 해마 슬라이스 준비를 이용했습니다. 카터 외는 만성 간질 동물로부터 제조된 결합된 해마-내측 피질 슬라이스가 시험관 외^16에서간질 방출을 자발적으로 생성할 수 있음을 입증하였다. 그 후, Karlócai 등은 변형된 인공 뇌척수액(ACSF)을 변경된 이온 농도(Mg²⁺ 또는 상승K⁺⁾또는 추가약물(4AP 또는 가바진)^17을사용하여 해마 슬라이스에서 간질 배전의 기전을 탐구하였다.

조사자들은 주요 방법으로 다른 수많은 해마 슬라이스 접근법을 개발했습니다: (1) 슬라이스에 포함된 해마 의 영역(등쪽, 중간 또는 복부); (2) 내측 피질과 같은 외격 조직의 존재 또는 부재; (3) 슬라이스를 자르는 데 사용되는 방향(관상, 처진, 수평 또는 경사); (4) 조직이 슬라이스 후 유지되는 조건(ACSF에 완전히 침수되거나 ACSF 및 가습, 환원이 풍부한 공기의 인터페이스에서 유지).

어떤 슬라이싱 접근 방식을 사용하는지는 실험목표에 의해 결정되어야 합니다. 예를 들어, 침수된 조건하에서 유지되는 등쪽 해마의 횡방향 또는 관상 슬라이스는 내격 회로 및 시냅스^{가소성(18,19,20)의}조사를 위해 매우 효과적으로 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 제제는 자발적으로 복부 해마(21),^{22,23로부터의}슬라이스로서 용이하게 네트워크 진동을 생성하지 않는다. 지속적인 SWR 활성상태는 등쪽 및 복부^{해마(24)로부터의}횡방향 슬라이스에서 파탄성 자극에 의해 유도될 수 있지만, 자발적인 SW는 복부 슬라이스^7,25에서보다 쉽게 관찰된다.

등쪽과 복부 해마 사이의 내재된 생리학적 및 해부학적 구별은 생체 내 및 체외²⁶모두에서 수행된 연구에 의해 지원된다. 쥐의 기록은 등대와 중간 해마 를 통해 강하게 일관된 테타 리듬을 드러냈지만, 복부 지역과 나머지 해마(27)의 일관성이 좋지^않았다. 생체 내 의 SW는 등쪽과 중간 해마 사이에 쉽게 전파되며, 복부 해마에서 발생하는 SW는 종종 지역^28로남아 있습니다. 회생 투영은 등쪽 및 중간 해마 프로젝트에 상주하는 CA3 피라미드 뉴런에서 유래하여 해마의 세로 축을 따라 먼 거리를 투영합니다. 복부 영역에서 유래한 CA3 프로젝션은 비교적 로컬로 유지되므로 슬라이스 공정^29,30중에 절단될 가능성이 적습니다. 따라서 복부 조각은 인구 동기화를 생성하는 데 필요한 반복 네트워크를 더 잘 보존할 수 있습니다. 체외에서 자발적인 네트워크 활동을 생성하는 복부 슬라이스의 성향은 또한 더 많은 등쪽 지역에 비해 복부 해마에서 피라미드 뉴런 또는 약한 GABAergic 억제의 높은 본질적인 흥분성을 반영할 수 있습니다^31. 실제로, 복부 해마 슬라이스는 간질 활성^32,33에더 취약하다. 따라서, 자발적인^{생리학적8, 9,11,24} 또는^{병리학적 16,34,35,36네트워크} 진동에 대한 많은 연구는 전통적으로 수평 슬라이스 접근법을 사용했으며, 때로는 프론토-후수 방향에 약간의 각도를 가지며, 이는 복부 해마의 횡측 평면과 평행한 조직 조각을 산출한다.

슬라이스의 많은 셀이 절단될 때 네트워크 연결은 슬라이싱 절차에 의해 불가피하게 영향을 미칩니다. 준비에 유지된 슬라이스와 조직의 각도와 두께는 관심 회로에서 연결을 최적화하는 것으로 간주되어야 합니다. 많은 연구는 생리학적 또는 병리학 적 네트워크 진동의 맥락에서 두 구조 사이의 상호 작용을 탐구하기 위해 수평 결합 해마 – 내측 피질 조각 (HEC)을 이용했다. Roth et al.은 HEC^{슬라이스(37)를}통해 SWR 활성의 전파를 입증하기 위해 내측 내측 피질의 해마 및 층 V의 CA1 서브필드에서 이중 레코딩을 수행하였다. 간질 활성의 많은 연구는 간질 방출이 코르티코모캄^{망(16,35,36,38)을}통해 전파되는 방법을 조사하기 위해 HEC 슬라이스^제제를사용했다. 손상되지 않은 코르티코히마막 루프의 보존은 자발적인 SW, 간질 방전 또는 감마 진동을 위한 전제 조건이 아니라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 네트워크 진동은 부착된 파라하마^{조직(21,22,23, 25,39,40,41)이}없는 등 또는 복부 해마의 횡방향 조각에서 생성될 수 있다. 해마 슬라이스에서의 네트워크 진동의 자발적인 생성을 위한 더 중요한 요소는 두꺼운 슬라이스(400-550 μm)가 CA2/CA3 재발^{네트워크(21,22,25)에서}더 많은 연결을 보존하기 때문에 각 슬라이스의 두께일 수 있다.

각진 수평 HEC 슬라이스(정면-후두 방향으로 약 12° 각도로 절단)가 코르티코히마항^{루프(11),16,34,35,42의}기능적 연결을 연구하는 데 사용되었지만, 이러한 각진 제제는 자발적인 네트워크^{활동(43,44,45)에}필요하지 않다. 그러나, 각진 슬라이싱 평면의 사용은 조사관이 하향 또는 위쪽 각도가 적용되는지 여부에 따라 복부 또는 중간 해마의 횡방향 방향 라멜라를 가장 잘 보존하는 슬라이스를 선택적으로 만들 수 있게한다(그림 1). 이 접근법은 개념적으로 파파테오도로풀로스 외, 2002년, 각 해마를 무료로 해부한 다음 조직 헬기를 사용하여 전체 등쪽-복부^축(21)을따라 횡방향 슬라이스를 만드는 것과 개념적으로 유사하다. 전술한 작용기와 등간 중간 해마 사이의 기능적 구별에 비추어, 조사관은 실험을 설계하거나 결과를 해석할 때 슬라이스의 해부학적 기원을 고려해야 한다. 슬라이스 시술 중에 한천 경사로를 사용하는 것은 중간 또는 복부 해마에서 슬라이스를 우선적으로 생산하는 간단한 방법입니다.

해마 슬라이스는 침수 된 챔버 (조직이 ACSF에 완전히 침지됨) 또는 인터페이스 스타일의 챔버 (예 : 오슬로 또는 하스 챔버,흐르는 미디어의 얇은 필름으로만 덮여 있는 슬라이스)에서 유지 될 수 있습니다. 인터페이스 유지 보수는 조직의 산소를 향상, 이는 신경 생존을 촉진하고 간 간 활동의 지속적인 높은 수준을 허용. 전통적으로 침수된 기록 조건은 네트워크 수준의 진동의 안정적인 발현을 위해 적절한 조직 산소화를 제공하지 않는 느린 ACSF 유량을 사용합니다. 침수 된 해마 슬라이스에서 carbachol 유도 감마 진동은 일시적으로 관찰된다^46,47,그들은 안정적으로 인터페이스 기록 챔버에서 유지 될 수있는 동안^10,48,49. 이와 같이, 시험관내 복잡한 자발적 활성에 대한 많은 연구는 급격한 파플리플 단지^{6,7,8,9,10,25,37,}감마 진동^10,13,및 간질 편성 활동^16,38,45,47을 조사하기 위해 인터페이스 기록^{챔버에 의존했다.}

침수식 기록실에서, 침지 현미경 목표는 개별 세포를 시각화하고 기록에 대한 건강한 세포를 선택적으로 표적으로 하는 데 사용될 수 있다. 침수 된 준비는 또한 세포 milieu에 미세 한 제어를 허용, 침수 조직에 약물 또는 다른 화합물의 급속 한 확산을 용이 하 게. 따라서 침수 된 조건에서 안정적인 네트워크 진동을 유지하는 수정 된 방법론은 강력한 실험 적 접근 방식을 나타냅니다. 이러한 접근법은 하호스 등의 작업에 의해 예시되며, 해마 슬라이스는 ACSF(~6mL/min)의 높은 유량으로 수정된 침수된 기록실로 이송하기 전에 몇 시간 동안 단순화된 인터페이스 스타일의 지주 챔버에서 회수하여^{조직(12,48,49)에}산소 공급을 향상시키는 데 서술된다. 이러한 조건하에서, 높은 수준의 인터뉴런 활동과 안정적인 자발적네트워크 진동은 침수된 기록실에서 유지될 수 있다. 이러한 수정된 접근법을 통해 조사관은 시각적으로 유도된 전세포 패치 클램프 레코딩을 수행하고 카바콜 유도 감마^{진동(12)에}형태학적으로 확인된 세포 유형의 기여를 특성화할 수 있다. SW는 또한 ACSF^11,48,49의빠른 유량으로 침수 된 해마 슬라이스에서 자발적으로 발생할 수 있습니다. Maier 등. 잠긴 기록 챔버로 옮겨지기 전에 인터페이스 챔버에서 회수된 해마 슬라이스가 자발적인 SW를 안정적으로 전시한 반면, 침수된 기록실로 옮겨지기 전에 비커에 잠긴 슬라이스는 더 작은 필드 응답, 낮은 수준의 자발적인 시냅스 전류, 그리고 자발적인 SWRs^43을거의 전시하지 않는 것을 보여주었습니다. 슐링로프 외.는 자발적인 SWRs^44의생성에서 파르팔알린 발현 바구니 세포의 역할을 입증하기 위해 이 향상된 방법론을 사용했다.

다음 프로토콜은 수평 해마 슬라이스에서 자발적으로 활성 뉴런을 인터페이스 조건하에서 회수하고 약리학적 또는 광유전학 적 조작 및 시각적으로 유도된 기록에 적합한 침수된 기록 챔버에서 유지될 수 있는 슬라이스 방법을 제시한다.