Summary

Isolamento e identificazione congiuntivale dei commensali nei topi

Published: May 01, 2021
doi:

Summary

Qui è presentato un protocollo per l’isolamento e l’amplificazione di batteri commenali congiuntivali anaerobici aerobici e facultativi del topo utilizzando un tampone oculare unico e una fase di arricchimento basata sulla coltura con successiva identificazione con metodi microbiologici basati e spettrometria di massa MALDI-TOF.

Abstract

La superficie oculare era un tempo considerata immune privilegiata e abiotica, ma recentemente sembra che ci sia una piccola ma persistente presenza commerciale. L’identificazione e il monitoraggio delle specie batteriche nella mucosa oculare sono stati impegnativi a causa della loro bassa abbondanza e della limitata disponibilità di una metodologia appropriata per la crescita e l’identificazione commensal. Esistono due approcci standard: metodi basati sulla cultura o sequenziamento del DNA. Il primo metodo è problematico a causa dei batteri recuperabili limitati e il secondo approccio identifica sia i batteri vivi che morti che portano a una rappresentazione aberrante dello spazio oculare. Abbiamo sviluppato un metodo robusto e sensibile per l’isolamento batterico basandoci su tecniche di coltivazione microbiologiche standard. Questa è una tecnica a base di tampone, utilizzando un tampone sottile “in-lab” realizzato che si rivolge alla congiuntiva inferiore, seguita da una fase di amplificazione per i generi anaerobici aerobici e facultativi. Questo protocollo ci ha permesso di isolare e identificare specie congiuntivali come Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. L’approccio è adatto a definire la diversità commenale nei topi in diverse condizioni di malattia.

Introduction

Lo scopo di questo protocollo è quello di migliorare l’isolamento specifico di microbi anaerobici aerobici e facultativi vitali e rari dalla congiuntiva oculare per caratterizzare il microbioma oculare. Studi approfonditi hanno profilato le comunità mucose commenali sulla pelle, l’intestino, le vie respiratorie e genitali e mostrano che queste comunità influenzano lo sviluppo del sistema immunitarioe la risposta 1,2,3. Le comunità commenali oculari hanno dimostrato di cambiare durante alcune patologie della malattia, come la malattia dell’occhiosecco 4,la sindrome di Sjogren5 e il diabete6. Tuttavia, la capacità di definire una tipica comunità commensale di superficie oculare è ostacolata dalla loro abbondanza relativamente bassa rispetto agli altri siti dimucosa 6,7,8. Ciò suscita una controversia sul fatto che esista un microbioma oculare residente e se esiste, se differisce dal microbioma cutaneo e, di conseguenza, il suo effetto locale sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario innato. Questo protocollo può aiutare a risolvere questa domanda.

Generalmente, gli approcci per definire la nicchia commensal oculare si basano sul sequenziamento e sulle tecnichebasate sulla cultura 4,7,9. 16 Il sequenziamento s rDNA e l’analisi BRISK7 mostrano una diversità più ampia rispetto alle tecniche basate sulla cultura, ma non sono in grado di distinguere tra microbi vivi e morti. Poiché la superficie oculare è ostile a molti microbi a causa delle proprietà antimicrobiche4 del film lacrimale che generano una vasta gamma di frammenti di DNA, gli approcci basati sul DNA rileveranno questi artefatti che possono distorcere i dati verso l’identificazione di batteri morti come commensal residenti piuttosto che contaminanti. Ciò si traduce in un’identificazione commensale aberrante e nella caratterizzazione dello spazio oculare come più elevato nell’abbondanza e nella diversità dei microbi10. Ciò rende difficile definire il microbioma oculare residente tramite metodi basati sul DNA. Considerando che le tecniche standard basate sulle impostazioni cultura non sono in grado di rilevare commensals perché il carico ètroppo basso 11. Il nostro metodo migliora le pratiche standard utilizzando un tampone sottile in grado di colpire la congiuntiva, evitando così la contaminazione dalla pelle vicina, così come il concetto che gli organismi vitali possono essere arricchiti da una breve coltura in mezzi densi di nutrienti con l’obiettivo di rianimare vitale ma non culturabile, oltre che arricchente per rari microbi vitali.

I risultati, l’abbondanza relativa di commensali oculari per tampone oculare, caratterizzano il microbioma residente congiuntiva e sono importanti per scopi comparativi. I nostri dati mostrano che c’è una differenza tra pelle e microbiota congiuntivale, così come una maggiore diversità con l’aumento dell’età e una differenza di abbondanza specifica per sesso. Inoltre, questo approccio ha trovato riproducibilmente differenze commenali nei topi knock-out12. Questo protocollo può essere applicato per descrivere il microbioma oculare che può variare a causa di pratiche di permanenza in gabbia, geografia o stato di malattia, così come gli effetti locali dei metaboliti commensali e dei prodotti sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono i topi seguono le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali. Segui le linee guida sulla sicurezza di laboratorio (come indicato dal tuo dipartimento istituzionale per la salute e la sicurezza ambientale) quando lavori con microrganismi e materiali potenzialmente contaminati. Utilizzare recipienti di rifiuti appropriati e procedure di decontaminazione prima dello smaltimento di materiali contaminati potenzialmente a rischio biologico. <p class="jove_tit…

Representative Results

I risultati rappresentativi di una piastra per tamponi per gli occhi che dimostra diversi metodi di placcatura sono raffigurati nella figura 3A che mostra isolati morfologicamente diversi dal mouse C57BL/6. Per ogni isolato distinto, le colonie sono state contate nella striscia e l’abbondanza relativa, unità di formazione delle colonie uniche (CTU) per tampone oculare, calcolate e tracciate a scopo di confronto. Per la caratterizzazione microbiologica, i batteri sono stati prelevati da sing…

Discussion

A causa dello stato paucibacterial della superficie oculare, molti laboratori hanno avuto difficoltà a isolare i commensaloculari 7,20, con conseguente basso numero di campioni con crescita, bassa abbondanza e bassa diversità8. Questo metodo migliora significativamente le pratiche di coltura standard4,21 con l’aggiunta di una fase di arricchimento, nonché un tampone per gli occh…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

I finanziamenti del P30 DK034854 hanno supportato VY, LB e studi nel Massachusetts Host-Microbiome Center e finanziamenti da NIH/NEI R01 EY022054 supportato MG.

Materials

0.1 to 10 µl pipet tip USA Scientific 1110-300 autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet Fisher Scientific 13-690-026
1 ml syringe Fisher Scientific BD309623 1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 autoclave before use
1000 µ ml pipet tip USA Scientific 1111-2021 autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) Fisher Scientific F123602G
25 G needle Fisher Scientific 14-826AA 1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide Fisher Scientific S25359
37 ° C Incubator Lab equipment
70 % Isopropanol Fisher Scientific PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) Santa Cruz Animal Health SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit Fisher Scientific B12539
Bunsen Burner Lab equipment
Clean paper towels Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton CVS
Disposable 1 ml Pipets Fisher Scientific 13-711-9AM for Gram stain and catalase tests
E.coli ATTC ATCC 8739
Glass slides Fisher Scientific 12-550-A3 for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml) Henry Schein 9950001
Mac Conkey Agar Plates Fisher Scientific 4321270 store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar Carolina Biological Supply 784641 Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice Jackson Labs C57/BL6J
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-12 for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media Fisher Scientific 50-488525 prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) EMD/Millipore, Fisher Scientifc SCGP00525 to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube Fisher Scientific 430829 anesthesia preparation
Sterile mouse cage Lab equipment
Tooth picks (round bamboo) Kitchen Essentials autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates Fisher Scientific 4321261 store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution BioMerieux Inc. Durham, NC 411071
Single use eye drops CVS Pharmacy Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each

References

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Cite This Article
Smith-Page, K., Kugadas, A., Lin, T., Delaney, M., Bry, L., Gadjeva, M. Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice. J. Vis. Exp. (171), e61672, doi:10.3791/61672 (2021).

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