Конъюнктивальная комменсальная изоляция и идентификация у мышей

Целью этого протокола является усиление специфического выделения жизнеспособных и редких аэробных и факультативных анаэробных микробов из глазной конъюнктивы для характеристики глазного микробиома. Обширные исследования профилировали комменсальные сообщества слизистой оболочки на коже, кишечнике, дыхательных и половых путях и показывают, что эти сообщества влияют на развитие иммунной системы и ответ^1,2,3. Было показано, что глазные комменсальные сообщества изменяются во время некоторых патологий заболевания, таких как болезнь сухого глаза^4,синдром Шегрена⁵ и диабет^6. Тем не менее, способность определять типичную комменсальную общность глазной поверхности затруднена их относительно низким содержанием по сравнению с другими участками слизистой^{оболочки 6,7,8.} Это вызывает споры о том, существует ли резидентный глазной микробиом и если он существует, отличается ли он от микробиома кожи и, следовательно, его местное влияние на развитие и реакцию врожденной иммунной системы. Этот протокол может помочь решить этот вопрос.

Как правило, подходы к определению окулярной комменсальной ниши основаны на методах секвенирования и культуры^4,7,9. 16 Секвенирование S рДНК и анализ BRISK⁷ показывают более широкое разнообразие, чем методы, основанные на культурах, но не могут различать живые и мертвые микробы. Поскольку поверхность глаза враждебна многим микробам из-за антимикробных свойств слезной пленки^4, генерирующих большой массив фрагментов ДНК, подходы, основанные на ДНК, будут обнаруживать эти артефакты, которые могут исказить данные в сторону идентификации мертвых бактерий как резидентных комменсалов, а не загрязняющих веществ. Это приводит к аберрантной комменсальной идентификации и характеристике глазного пространства как более высокого по численности и разнообразию микробов¹⁰. Это затрудняет определение резидентного глазного микробиома с помощью методов на основе ДНК. Принимая во внимание, что стандартные методы, основанные на культуре, не могут обнаружить комменсалы, потому что нагрузка слишком низкая¹¹. Наш метод улучшает стандартную практику, используя тонкий тампон, который может нацеливаться на конъюнктиву, тем самым избегая загрязнения от соседней кожи, а также концепцию, что жизнеспособные организмы могут быть обогащены кратковременной культурой в питательных плотных средах с целью реанимации жизнеспособных, но не культивируемых, а также обогащения редкими жизнеспособными микробами.

Результаты, относительное обилие глазных комменсалов на глазной мазок, характеризуют конъюнктивный резидентный микробиом и важны для сравнительных целей. Наши данные показывают, что существует разница между микробиотой кожи и конъюнктивы, а также большее разнообразие с увеличением возраста и специфической для пола разницей в изобилии. Кроме того, этот подход воспроизводимо обнаружил комменсальные различия у нокаут-мышей^12. Этот протокол может быть применен для описания глазного микробиома, который может варьироваться из-за практики клетки, географии или состояния заболевания, а также местных эффектов комменсальных метаболитов и продуктов на развитие и реакцию иммунной системы.