미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.
미토콘드리아 역학은 세포기관의 다양한 기능과 세포 반응에 필수적입니다. 혼잡하고 공간적으로 복잡한 미토콘드리아 멤브레인은 규제 요인을 구별하는 어려운 환경입니다. 단백질과 지질 성분의 실험적 제어는 규제의 특정 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 이러한 요인의 정량적 조작은 세포 분석에서 어렵습니다. 미토콘드리아 내막 융합의 분자 메커니즘을 조사하기 위해 미토콘드리아 내막의 지질 환경을 모방한 체외 재구성 플랫폼을 도입했습니다. 여기에서 우리는 지질 이중층을 준비하고 미토콘드리아 막 단백질을 재구성하기 위한 상세한 단계를 설명합니다. 이 플랫폼은 미토콘드리아 내막 융합및 개별 전이를 위한 운동학의 중간체분석을 정량적 방식으로 분석할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 비대칭 지질 조성을 가진 이중층의 제조를 설명하고 완충된 양층으로 막음 단백질을 재구성하기위한 일반적인 고려 사항을 설명합니다. 이 방법은 다른 멤브레인 시스템을 연구하기 위해 적용될 수 있다.
막 구획화는 진핵 세포 1(도 1A)의특징입니다.1 생물학적 멤브레인은 2차원 용매 이상으로 점점 더 인식되고 있으며, 단백질 기능 및 거시 분자 복합 조립2,,3을조절하는 데 중요한 역할을 하는 환경으로 간주됩니다. 네이티브 지질은 막 단백질 활성3,,4를조절하는 리간드입니다. 멤브레인 공간 조직과 다양한 모양으로 조각되는 멤브레인의 능력은 새로운 함수3,,5를선택하는 데 중요한 물리적 특성입니다.
모델 멤브레인 플랫폼은 세포막 구조, 역학 및,기능6,7,78을이해하는 데 도움이 되는 생체 모방 시스템입니다. 모델 멤브레인은 전형적으로 정의된 생체 물리학적 특성(강성, 두께 및 탄력)을 가진 잘 정의된 조성물의 지질 혼합물을 포함한다. 형광 이미징에 결합된 모델 멤브레인 플랫폼은 멤브레인 구조 및 기능9,,10,,11의정량적 분석을 허용합니다. 지질 이중층 재구성 전략은 SNARE 매개 막 융합9,,10,DNA 매개 막 융합12,바이러스 융합11,,13을연구하기 위해 사용되어 왔다. 이러한 방법의 장점은 관찰 가능한 반응이벤트(14)에앞서 중간 단계에 대한 운동 정보를 얻을 수 있는 가능성이있다.
플라즈마 멤브레인은 모델 멤브레인을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다. 지질상 분리를 갖는 쌍층은 세포 신호11,,15,,16에서중요한 지질 뗏목 구조를 연구하기 위해 개발되었다. 마이크로패턴 지질 평면 이중층17,,18세포 수용체의 조직을 조사하는 데 사용되어 왔다. 중합체 또는 겔 지원 멤브레인은 막 세포골격 조직을 연구하기 위해 생체 모방 시스템으로 사용되어 왔으며, 세포 신호 화 시 막 단백질 분할, 세포-세포접촉(19)에서의이주로 사용되었다.
인공 멤브레인 시스템은 또한 세포 외 세포 세포기관을 연구하기 위해 적용되고있다(20). 소기관은 고유한 하위 환경을 만드는 특징적인 형태를 특징으로 합니다. 내풍술 망막(ER) 네트워크는 한 가지 예입니다. 리포솜으로 망상을 재구성하면 세포 ER과 유사한 특성을 가진 관 막 구조가형성된다 21. ER 융합 단백질인 아틀라스틴을 첨가하면 리포솜으로부터 지질 튜블러를 유도하여네트워크(20)를형성할 수 있다. 이것은 proteoliposomes가 세포구 형태학 및 역학에 대한 기능적 통찰력을 제공하는 방법에 대한 한 가지 예입니다.
미토콘드리아 막 융합 및 핵분열은 미토콘드리아 인구22,,23,,24,,25의건강에 필수적이다. 다이너마이가족 GTPases세트는 미토콘드리아 막 융합을 촉매합니다. Mfn 1/2는 외부 막 융합을 촉매합니다. Opa1은 내부 막융합(26)을 중재한다(도1B). Opa1은 두 가지 형태를 가지고 있습니다: 긴 형태 (l-Opa1), 미토콘드리아 내막에 고정된 막 막, 및 막 간 공간에 존재하는 ‘용해성’ 짧은 형태 (s-Opa1)가 있습니다. 두 Opa1 형태의 비율은 두 프로테아제, Oma1 및 Yme1L27,,28,,29,,30의활성에 의해 조절된다. Opa1 규정의 중요한 질문은 다음과 같습니다 : Opa1의 두 가지 형태, (짧고 긴) 중도 막 융합 및 규제 상호 작용28,,29,,31,,32,,33.
여기서 우리는 성공적으로 내부 막 융합에서 l-와 s-Opa1의 역할을 명확히 미토콘드리아 내부 막 융합을 조사하기 위해 적용 된 재구성 전략을 설명합니다. 우리는 폴리머 테더지질 바이레이어와 200 nm unilamellar 소포를 사용하여 미토콘드리아 내막을 모방하는 플랫폼을 개발했습니다. 지질 이중층 아래에 있는 폴리머 밧줄의 이점은 다음을 포함한다. 첫째, 재구성된 막 단백질을 보존하며, 이는 유리슬라이드(34)에근접하여 중단될 수 있다. 둘째, 지질 이중층과 유리 기판 사이의 두꺼운 물층을 제공하며, 이는 공공 개방9의연구를 용이하게 하며, 제3페 폴리머의 점탄성 특성으로 막 곡률변화(35)를허용한다. 우리는 멤브레인 융합(도 1C-F)의단계를 특성화하기 위해 3 색 형광 이미징을 사용했습니다.
그림 1: 미토콘드리아 막 융합 모니터링.
(A)세포기관은 세포막 구획이다. (B)미토콘드리아 막 융합의 순차적 단계. 미토콘드리아의 외부 막의 융합은 Mfn1 및/또는 Mfn2에 의해 촉매화되고, 내막 융합은 Opa1에 의해 중재된다. (C-F) 미토콘드리아 막 융합을 연구하기 위해 체외 재구성 플랫폼의 회로도. 이 플랫폼에는 프로테오올리포솜과 폴리머 테더드 지질 이중레이어, 재구성된 l-Opa1의 두 가지 부분이 포함되어 있습니다. 두 개의 다른 형광막 염료와 함량 마커를 포함한 형광 라벨은 멤브레인 융합 중 단계를 구별하는 데 도움이됩니다. 두 개의 멤브레인 마커 (Cy5-PE (빨간색) 및 텍사스레드 PE (주황색)는 가까운 멤브레인 도킹에 대해보고 할 수있는 FRET 쌍을 만듭니다. proteoliposome 라벨 텍사스Red-PE의 확산은 지질 디믹싱의 지표입니다 (혈류). 콘텐츠 릴리스는 칼신 신호의 해수를 통해 모니터링됩니다(녹색으로 표시됨). 바이오렌더를 사용하여 만든 패널 A와 B. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시험관 내 모델 멤브레인 시스템은 잘 정의된 조건하에서 복잡한 멤브레인 프로세스를 설명할 수 있습니다. 이러한 시스템은 분자 메커니즘6,15,,20,,38을드러내기 위해 복잡한 분자 공정에 필요한 최소한의 구성 요소를 구별할 수 있다., 막 단백질의 경우, 리포솜과 평면 지원 이중층은 일반적인 재구성 시스템입니다. 고체 지원 지질 양층과는 달리, 폴리머 테더바이층의 기판과 지지막 사이의 폴리머 쿠션은 대형 멤브레인 단백질의 자유로운 이동성을 허용하고, 막 단백질은 자유롭게 확산및조립34를허용한다. 이러한 특징은 우리가 미토콘드리아 내막 융합36의운동학을 조사하는 데 도움이.
우리는 랭뮤어-블로젯/랭뮤어 셰퍼(LB/LS) 기술을 사용하여 폴리머 테더지질 바이레이어를 준비했습니다. 이를 통해 비대칭 지질 성분이 있는 바이레이어를 준비할 수 있습니다. 세포막은 비대칭 전단지 조성물을 가지며, LB/LS 접근법은 이러한 이중층의 연구를 허용한다. 쉐퍼 전달을 사용하면 전체 유리 기판이 지질 이중 층으로 덮을 수 있습니다. 이중 레이어 준비를 위해 깨끗한 표면을 준비하는 것이 중요합니다. 또한 쉐퍼 전송을 올바르게 수행하는 연습이 필요합니다. 실패한 쉐퍼 전송은 지질 이중 층에서 원치 않는 결함을 만들 수 있습니다. 이 프로토콜에서 필름 밸런스에 첨가된 압력은 20% 심폐진을 함유하는 이중층에 적용됩니다. 다른 구성 요소와 이중 레이어의 경우 주요 구성 요소의 표면 압력 영역 이더렘을 참조하십시오. 다른 방법은 Langmuir-Blodgett/소포 융합(LB/VF) 방법으로, 하부 지질 단층이 랭뮤어 트로프의 공기-물 인터페이스에서 깨끗한 기판으로 옮겨진 다음, 리포솜이 지원되는 지질 단층의 상부로 융합되어 최종이중층(39)을형성한다. LB/VF 방법을 사용하는 멤브레인 단백질의 재구성은 프로테오폴좀의 융합을 통해 재구성이 수행될 수 있기 때문에 LB/LS보다 더 간단하다. 그러나, 소포 융합은 과잉 리포좀의 추가를 요구합니다, 이는 농도 의존적인 단백질 단백질 상호 작용에 의존하는 막 사건의 연구를 복잡하게 할 수 있습니다.
바람직한 기능성 방향에서 폴리머 테더지질 이중층과 리포솜으로 막 이상 단백질의 성공적인 재구성은 중요하지만 시행하기어렵다. 이를 설명하기 위해서는 실험 컨트롤이 필요합니다. 폴리머 테더지질 이중층의 경우, 재구성 하는 동안 지질 이중 층의 무결성을 유지 하는 것이 중요 하다. 계면활성제 농도는 지질 이중층을 용해시키는 것을 방지하기 위해 상대적으로 낮게 유지되어야 하지만, 관심 있는 단백질의 저하를 방지할 수 있을 만큼 충분히높음(37,,40). 여기에서 기술된 방법은 단 하나 분자 연구를 위한 막 단백질을 재구성하는 데 이상적이지만 대규모 연구를 위해 반드시 확장가능한 것은 아닙니다. 계면 활성제 선택은 또 다른 중요한 고려 사항입니다. 정제 및 보관에 사용되는 계면활성제는 좋은 출발점이 되는 경우가 있습니다. 계면활성제의 최대 농도는 일반적으로CMC(36)의200배 이하이며, 계면활성제가 단백질 안정성을 유지하고 단백질 응집을 방지하는 범위에서멤브레인(36)의무결성을 유지한다. 계면활성제 2개 또는 3개가 함유된 칵테일을 고려할 수 있습니다. 리포솜으로 재구성하기 위해서는 계면활성제의 낮은 농도가 필요하지 않습니다. 그러나, CMC 이하의 계면활성제 농도는 리포솜에 대한 균일한 크기 및 형태 분포를 유지하는 것이 바람직하다. 내용 염료의 누출을 방지하기 위해 염료 함유 버퍼에 대해 투석할 필요가 있습니다.
리포솜 기반 융합 분석과는 달리, 우리가 설립한 플랫폼은 멤브레인 융합의 각 단계의 운동학을 조사하는 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 거의 네이티브 조건하에서 막 간 융합 단백질을 연구하는 기능을 제공합니다. 모델 멤브레인 플랫폼은 미토콘드리아 내막과 같은 세포 외 환경에서 막 단백질 조립 및 올리고머화, 멤브레인 “조각”및 단백질 지질 상호 작용을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 이 방법은 또한 이중층 조성 비대칭과 같은 막 단백질 상호 작용에서 중요한 생리적 조건을 탐구할 수 있게 합니다. 리포솜과 폴리머 지원 이중층의 이중층 특성에서 주요 미토콘드리아 지질, 심막의 역할은 정의되어야 한다. 이온 강도, 막 두께, 막 강성, 멤브레인 곡률 및 멤브레인 탄성 점도 특성과 같은 특성은 모두 단백질이 특정 기능 상태로 조립하는 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 모형 막 시스템을 창의적으로 적용하는 미래 연구는 막 단백질 조직 및 기능의 새로운 양상을 밝힐 가능성이 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 찰스 H. 후드 재단 아동 건강 연구 상에서 지원과 매사추세츠 종합 병원에서 분자 생물학의 부서에서 관대 한 지원을 인정합니다.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |