ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

脂質混合物の調製 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレノイル-snグリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPE)、L-α-ホスファチジルイノシトール(肝臓PI)、カーディオリピン、カーディオリピン、カーディオリピン、カーディアリピン、1,2-ジオレオイル-sn-3ホスホコリンを溶解させることにより、脂質ストック溶液を調製 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](18:1 PEG2000 PE)を25mg/mLの濃度でクロロホルムに。蛍光色素共役脂質(テキサスレッドDHPEおよびCy5 DOPE)クロロホルムを1mg/mLの濃度で溶解します。脂質溶液をクロロホルム耐性ライナーでアンバーバイアルに保管し、ポリテトラフルオロエチレンテープでさらに密封します。溶液は-20°Cで6ヶ月まで保つことができます。 ソリューション A と B を作成します。 混合脂質は、DOPC(52.8モル%)、法王(20モル%)、肝臓PI(7モル%)を含む溶液A(最終濃度1mg/mL)を調製するためにそしてカーディオリピン(20モル%)、および0.2モル%のフルオロフォア。 DOPC(47.8モル%)、法王(20モル%)、肝臓PI(7モル%)、カージオリピン(20モル%)を含む溶液B(最終濃度1mg/mL)を作るDOPE-PEG2000(5モル%)、および0.2モル%のフルオロフォア。 ガラスシリンジを使用して、計算された貯蔵溶液をアンバーバイアルに添加して脂質混合物を生成します。バイアルに余分なクロロホルムを追加することにより、最終的なボリュームを一致させます。注:FCS(蛍光相関分光法)の場合、色素共役脂質の比率を0.002mol%に下げ、残りをDOPCで置き換えてください。 脂質二重層の作製 顕微鏡カバーガラスは520°Cで30分間滑ります。焼いた後、カバースライドを室温まで冷やします。 約10gの水酸化ナトリウムの重量を量り、攪拌しながら500mLのメタノールを加えます。2時間撹拌し、沈殿が現れるまで溶液中に水酸化ナトリウムを添加し続ける。全体のプロセスの間に適切なPPEを着用することを確認してください。 10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液でガラススライドをきれいにします。メタノールは、水酸化ナトリウムで飽和;50 mM塩酸、順次(30分間の各条件下での浴超音波処理)。各条件の間に10分間超純水でガラススライドを清掃します。注:ガラススライドの準備に新鮮なソリューションを使用することを強くお勧めしますが、各ソリューションは5倍以内または1ヶ月以内に再利用できます。使用前に溶液を攪拌してください。 洗浄カバーガラスをHCl溶液に密封して2週間まで保管し、良好な二重層品質を確保します。超純水に保存されている場合は、1週間以内にスライドを使用してください。 トラフに湿気が見られないまで、クロロホルムと超純水を使用して、ラングミュア・ブロジェット浸漬システムのポリテトラフルオロエチレントラフを洗浄します。トラフ表面にクロロホルムをスプレーし、セルロースワイプ3xで十分に拭きます。超純水ですすい、吸引によって水を取り除きます。3x を繰り返します。 トラフの表面をきれいな超純水で覆います。 洗浄液または超純水から表面処理カバーガラスを2個取り、約30sの超純水でガラススライドを洗い流します。 カバーグラスをバックツーバックに配置します。基板クランプを使用して、ガラススライドを保持します。Langmuir コントロール ソフトウェアの「ディッパーダウン」を手動でクリックして、水面の下にガラススライドを浸します。 フィルムバランスをゼロにし、空気水界面でのドロップによって溶液Bを慎重に広げる(図2A)。脂質が空気と水の界面でのみ広がっていることを確認し、クロロホルムと脂質滴がポリテトラフルオロエチレン表面の底に沈まないようにしてください。 これを確実にしないと、脂質の「チャネル」が作成され、単層形成を防ぐことができます。 〜15〜20 mN/m前後でフィルムバランスが読み出されるまで脂質を加えるのをやめて、~10~15分待ちます。37 mN/mまでのフィルムバランスの読み出しまで、「実験開始」をクリックして、表面積を変更するためにバリアコントローラを開始します。~20~30分間の圧力を保つ(図2B)。 表面張力を37 mN/mに保ちながら、カバーガラスを22mm/分の速度で上げます。ポリマーテザリングを有する脂質単層は、ブロジェット浸漬プロセスを通じて、空気-水界面からカバーガラスの表面に移される(図2C)。これは脂質二重層の底のリーフレットを形成する。 吸引によって空気水界面をきれいにし、超純水でトラフを洗い流す。 クロロホルム、エタノール、超純水を使用して、片めのガラススライド(例えば、シェーファースライド)を洗浄してください。水層の下に超純水でトラフの上にきれいなガラススライドを設定します。井戸が空気と水の界面に向かっていることを確認し、ガラススライドが完全に覆われるまで新鮮な超純水を注ぎます。ステップ 2.8 を繰り返します。 シリコン吸引カップを使用してステップ2.4から脂質単層をカバーガラスに保持し(単層側が吸引カップから離れることを確認し、脂質単層を空気-水界面に静かに押し込み、インタフェースで〜2〜3sのカバーガラスを保持し、スライドにカバーガラスを押し付けます)スライドをカバースライドで取り出します。注:脂質二重層は、カバーガラスの表面に、2つのスライドの間の挟まれた領域に面して保持されます(図2E)。 二重層のカバーガラスを蛍光顕微鏡に持って行きます。脂質二重層を画像化する。脂質染料の均質な分布が観察された場合、2層の小さな領域を30sのフォトブリーチし、~30s-1分間光源をオフにし、再度画像を回復観察する。脂質二重層は、蛍光回復を示す。注:欠陥や蛍光回復不良を有する膜は、それ以上の実験には使用しないでください。 図2:ポリマーテザリング脂質二重層を作るステップ。ラングミュア・ブロジェット浸漬(A-C)およびラングミュア・シェーファー転移(D)技術を用いて脂質二重層を作るステップ。(E) 脂質二重層を含む最終的な「サンドイッチ」。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. タンパク質のポリマー・テザリング脂質二重層への再構成 超純水を含む結晶化皿を準備します。きれいな顕微鏡のイメージリングを準備し、皿の下に置きます。 水の下に脂質二重層を含むシェーファースライドとカバーガラスの「サンドイッチ」を浸し、シェーファースライドとカバーガラスを優しく分離し、カバーガラススライドを底面から保持し、二層側から離れ、カバーガラスを画像リングに移し、画像リングを閉じる。注:脂質二重層を含むカバーガラスが常に水中にあり、リングが十分に密閉されていることを確認してください。 画像リング内の超純水をBis-Tris NaClバッファーに置き換え、脂質二重層が気泡にさらされないようにします。脂質二重層に1.1 x10-9 M n-オクチル-β-D-グルコピラノシドを加える。DDMの1.2 x10-9 Mと1.3 x10-12モルの精製l-Opa136の混合物を画像リングにすぐに加えます。ベンチトップシェーカー上のサンプルを低速で2時間インキュベートする(図3)。注:洗剤は、再構成されるタンパク質によって異なる場合があります。 30 mg SM-2 樹脂ビーズを 3 mL のビストリス バッファーに分配し、塗布前に振ります。プラスチックピペットを使用して、SM-2樹脂ビーズの5〜10 μLを画像リングに加え、10分間インキュベートし、リンスして樹脂ビーズを除去します。イメージリングのバッファーの最終ボリュームは 1.5 mL です。 図3:l-Opa1をポリマーテザリング脂質二重層に再構成する手順。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 4. プロテオリポソームの調製 クロロホルム溶液中に1mgの脂質混合物Aを調製する。窒素流下で20分間クロロホルムを蒸発させ、一晩真空下に置き、脂質膜を形成します。 カルセイン15.56gを1.5モルNaOH溶液の50mLに溶解させて50mMカルセイン含有液を調製し、カルセインが完全に溶解するまで室温で攪拌し、12.5mビストリスと超純水を最終体積500mLに加える。pH を 7.5 に調整します。 カルセイン含有緩衝液中の脂質膜を懸濁し、200nmのリポソームをポリカーボネート膜を用いて200nmリポソームで65°Cで懸濁液を加熱して脂質を完全に水和する。 0.5 μM DDM に 2 μg の l-Opa1 を 0.2 mg リポソームに加え、4 °C で 1.5 時間インキュベートします。250 mlのビストリス、150 mM NaCl、50 mM calcein バッファーを一晩で 250 ml に対して 3.5 kDa 透析カセットを使用して、透析によって界面活性剤を取り出し、バッファーを 2 回変更します。 PD-10脱塩カラムを使用して余分なカルセインを除去します。 5. イメージングとデータ解析 100x油浸性目標(N.A 1.4)を使用してTIRF画像を取得します。カルセインでカプセル化されたTexasRed-PE標識リポソームおよびプロテオリポソームの分析には、543 nmレーザーと488nmレーザーを使用してください。平坦な脂質二重層に埋め込まれたCy5-PEの分析には633 nmレーザーを使用してください。 脂質二重層を使用してTIRF角度を合わせて最大の放出を得る。再構成後の脂質二重層の品質は、25°Cで100x油目的を用いて観察される。 リン脂質と再構成二重層の拡散係数は、他の37のプロトコルを用いてFCSを用いて決定される。 2 mg/mLプロテオリポソーム10μLを画像リングに加え、画像の10分前にセットします。GTP、GMPPCP、またはGDPは、1 mM MgCl2 および1 mMのヌクレオチドで反応リングに添加される。 膜融合におけるs-Opa1の影響を決定するために、s-Opa1をl-Opa1を含むプロテオリポソーム/支持された二重層サンプルに滴定し、融合事象を記録する。 テキサスレッド-DHPEとカルセインの同時イメージングはビーム分割システムを通して達成される。488 nmおよび543 nmのレーザーは両方とも、蛍光励起源としてサンプルに同時に適用される。次いで、発光光を560 nmのビームスプリッターを使用して分割します。スプリットエミッションライトは、42 nmの帯域幅と40 nmの帯域幅を持つ609 nmフィルタを備えた510 nmフィルタでフィルタリングされます。フィルターされたビームはカメラ チップの 2 つの隣接する領域に投影されます。 蛍光発光は、帯域幅が 40 nm の 609 放出フィルタと、帯域幅 70 nm の 698 放出フィルタを通じて同時に記録されます。顕微鏡システムは-10 °Cに維持されるCMOSのカメラが装備されている。 リポソームの粒子同定は、ガウスベースの粒子認識アルゴリズムを用いて行うことができる。粒子分布と強度はチャンネルごとに解析されます。脂質二重層シグナルは、粒子を分離するためのマスクとして使用されます。