Summary

Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Published: May 15, 2020
doi:

Summary

Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.

Abstract

Nous décrivons la procédure étape par étape pour cultiver et différencier les cellules souches embryonnaires de souris en lignées neuronales, suivie d’une série de tests pour caractériser les cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires de souris E14 ont été utilisées pour former des corps embryoïdes par la méthode de la goutte suspendue, puis induites à se différencier en cellules progénitrices neurales par l’acide rétinoïque, et enfin différenciées en neurones. Des expériences quantitatives de réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-qPCR) et d’immunofluorescence ont révélé que les progéniteurs neuronaux et les neurones présentent des marqueurs correspondants (nestin pour les progéniteurs neuronaux et neurofilament pour les neurones) aux jours 8 et 12 après la différenciation, respectivement. Des expériences de cytométrie en flux sur une ligne E14 exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 ont montré qu’environ 60% des cellules au jour 8 sont GFP positives, indiquant la différenciation réussie des cellules progénitrices neurales à ce stade. Enfin, l’analyse ARN-seq a été utilisée pour profiler les changements transcriptomiques globaux. Ces méthodes sont utiles pour analyser l’implication de gènes et de voies spécifiques dans la régulation de la transition de l’identité cellulaire au cours de la différenciation neuronale.

Introduction

Depuis leur première dérivation à partir de la masse cellulaire interne des blastocystes de souris en développement1,2,les cellules souches embryonnaires de souris (CSM) ont été utilisées comme outils puissants pour étudier l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches3. En outre, l’étude de la différenciation des CSM conduit à une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires qui peuvent améliorer l’efficacité et la sécurité de la thérapie à base de cellules souches dans le traitement de maladies telles que les troubles neurodégénératifs4. Par rapport aux modèles animaux, ce système in vitro offre de nombreux avantages, notamment la simplicité dans la pratique et l’évaluation, le faible coût de maintien des lignées cellulaires par rapport aux animaux et la facilité relative des manipulations génétiques. Cependant, l’efficacité et la qualité des types de cellules différenciés sont souvent affectées par différentes lignées de cSM ainsi que par les méthodes de différenciation5,6. En outre, les tests traditionnels pour évaluer l’efficacité de la différenciation reposent sur un examen qualitatif de gènes marqueurs sélectionnés qui manquent de robustesse et ne parviennent donc pas à saisir les changements globaux dans l’expression des gènes.

Ici, nous visons à utiliser une batterie de tests pour l’évaluation systématique de la différenciation neuronale. En utilisant à la fois des analyses in vitro traditionnelles sur des marqueurs sélectionnés et des séquençages d’ARN, nous établissons une plate-forme pour mesurer l’efficacité de la différenciation ainsi que les changements transcriptomiques au cours de ce processus. Sur la base d’un protocole précédemment établi7,nous avons généré des corps embryoïdes (EB) grâce à la technique de la goutte suspendue, suivie d’une induction utilisant une quantité supraphysiologique d’acide rétinoïque (PR) pour générer des cellules progénitrices neurales (NPC), qui ont ensuite été différenciées en neurones avec un milieu d’induction neuronal. Pour examiner l’efficacité de la différenciation, en plus des tests traditionnels de RT-qPCR et d’immunofluorescence (FI), nous avons effectué une cytométrie d’ARN-seq et de cytométrie en flux. Ces analyses fournissent une mesure complète de la progression de la différenciation spécifique au stade.

Protocol

1. Culture mESC Enduisez une plaque de 10 cm traitée par culture tissulaire de 0,1 % de gélatine et laissez la gélatine reposer pendant au moins 15 à 30 minutes avant de l’aspirer. Graine γ fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) irradiés un jour avant la culture des CSM dans le milieu mESC préchauffé (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 15% de sérum fœtal bovin (FBS), acides aminés non essentiels, β-mercaptoéthanol, L-glutamine, pénicilline/streptomycine, pyruvate de sodium, LIF…

Representative Results

En tant que représentation de notre méthode, nous avons effectué une expérience de différenciation EB, NPC et neuronale sur des cellules E14. Les cellules E14 ont été cultivées sur des MEF γ irradiés(figure 1A)jusqu’à ce que la population de MEF irradiés par γ se dilue. Nous avons confirmé la pluripotence des cellules E14 en effectuant une coloration à la phosphatase alcaline (AP)(Figure 1B)et plus tard rt-qPCR (voir ci-dessous) pour les marqueu…

Discussion

La méthode de différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris est établie depuis des décennies et les chercheurs ont continué à modifier les protocoles précédents ou à en créer de nouveaux à des fins diverses7,10,11. Nous avons utilisé une série de tests pour analyser de manière exhaustive l’efficacité et la progression des étapes de différenciation des CSM en neurones, qui peuvent être…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (1R35GM133496-01) à Z. Gao. Nous tenons à remercier le Dr Ryan Hobbs pour son aide dans le sectionnement. Nous remercions les installations de base du Penn State College of Medicine, notamment les sciences du génome et la bioinformatique, l’imagerie par microscopie optique avancée et la cytométrie en flux. Nous remercions également le Dr Yuka Imamura pour son aide dans l’analyse de l’ARN-seq.

Materials

0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X Corning 25-052-CV
0.1% Gelatin Sigma G1890-100G Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28908 Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer Falcon 352340
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11001 Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox Azura Genomics AZ-2105
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSCanto BD 657338
bFGF Sigma 11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Chir99021 Cayman Chemicals 13122
Chloroform C298-500 Fisher Chemical
DAPI Invitrogen R37606
DMEM Corning 10-017-CM
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320033
EB buffer Qiagen 19086
Ethanol 111000200 Pharmco Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY-401-2501
Isopropanol BDH1133-4LG BDH VWR Analytical Diluted in de-ionized water
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIF N/A N/A Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers IDTDNA N/A 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids Corning 25-025-Cl
mNanog primers IDTDNA N/A 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers IDTDNA N/A 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers IDTDNA N/A 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers IDTDNA N/A 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers IDTDNA N/A 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin primary antibody Millipore MAB5326 Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament primary antibody DSHB 2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit BioO Scientific NOVA-5138-07
PD0325901 Cayman Chemicals 13034
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A Prepared in de-ionized water
– Potassium chloride P217-500G VWR
– Potassium phosphate monobasic anhydrous 0781-500G VWR
– Sodium chloride BP358-10 Fisher Bioreagents
– Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate SX0715-1 Milipore
Random hexamer primer Thermo Scientific SO142
Retinoic acid Sigma R2625 Prepared in DMSO
Sodium pyruvate Corning 25-000-Cl
Sucrose Sigma 84097 Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen 18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583
TriPure Isolation Reagent Sigma-Aldrich 11667165001
TruSeq Rapid Illumina 20020616
β-mercaptoethanol Fisher BioReagents BP176-100

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Cite This Article
Hanafiah, A., Geng, Z., Wang, Q., Gao, Z. Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (159), e61446, doi:10.3791/61446 (2020).

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