בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר
Summary
אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.
Abstract
אנו מתארים את ההליך שלב אחר שלב לפולחן והבחנה של תאי גזע עובריים של עכברים לשושלות עצביות, ואחריו סדרה של גישות לאפיון התאים המובחנים. תאי הגזע העובריים של עכבר E14 שימשו ליצירת גופים עובריים באמצעות שיטת טיפת התלוי, ולאחר מכן הושרו כדי להבדיל לתאי אב עצביים על ידי חומצה רטינואית, ולבסוף נבדלו לנוירונים. תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי (RT-qPCR) וניסויים אימונופלואורסצנטיים גילו כי האבות העצביים והנוירונים מציגים סמנים מתאימים (קטין לאבות עצביים ו neurofilament עבור נוירונים) ביום 8 ו -12 לאחר בידול, בהתאמה. ניסויי ציטומטריית זרימה על קו E14 המבטאים כתב GFP מונחה מקדם Sox1 הראו כי כ -60% מהתאים ביום 8 הם חיוביים GFP, המציין את ההבחנה המוצלחת של תאי אב עצביים בשלב זה. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח RNA-seq כדי לפרופיל השינויים התמלוליים הכלליים. שיטות אלה שימושיות לניתוח מעורבותם של גנים ומסלולים ספציפיים בוויסות המעבר לזהות התא במהלך בידול עצבי.
Introduction
מאז ההפקה הראשונה שלהם מן מסת התא הפנימי של blastocysts העכבר המתפתח1,2, תאי גזע עובריים עכבר (mESC) שימשו ככלים רבי עוצמה כדי ללמוד התחדשות עצמית של תאי גזע ובידול3. יתר על כן, לימוד בידול mESC מוביל להבנה עצומה של מנגנונים מולקולריים שעשויים לשפר את היעילות והבטיחות בטיפול מבוסס תאי גזע בטיפול במחלות כגון הפרעות ניווניות4. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, מערכת במבחנה זו מספקת יתרונות רבים, כולל פשטות בפועל והערכה, עלות נמוכה בשמירה על קווי תאים בניגוד לבעלי חיים, וקלות יחסית במניפולציות גנטיות. עם זאת, היעילות והאיכות של סוגי תאים מובחנים מושפעים לעתים קרובות מקווים שונים של mESCs, כמו גם משיטות הבידול5,6. כמו כן, הבדיקות המסורתיות להערכת יעילות הבידול מסתמכות על בדיקה איכותית של גנים נבחרים של סמן חסרי חוסן ולכן הם אינם מצליחים לתפוס שינויים גלובליים בביטוי הגנים.
כאן אנו שואפים להשתמש בסוללה של התקפות להערכה שיטתית של ההבחנה העצבית. באמצעות ניתוחי הפריה במבחנה מסורתיים על סמנים נבחרים ו- RNA-seq, אנו מקימים פלטפורמה למדידת יעילות הבידול, כמו גם את השינויים התמלוליים במהלך תהליך זה. בהתבסס על פרוטוקול שהוקם בעבר7, יצרנו גופים עובריים (EBs) באמצעות טכניקת טיפה תלויה, ואחריו אינדוקציה באמצעות כמות על-פיזיולוגית של חומצה רטינואית (RA) כדי ליצור תאי אב עצביים (NPCs), אשר לאחר מכן הובדלו נוירונים עם מדיום אינדוקציה עצבית. כדי לבחון את היעילות של הבידול, בנוסף לבדיקות RT-qPCR ואימונופלואורסצנטיות (IF) מסורתיות, ביצענו רנ”א-סק וציטומטריית זרימה. ניתוחים אלה מספקים מדידה מקיפה של התקדמות הבידול הספציפי לשלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה לבידול עצבי של תאי גזע עובריים של עכבר הוקמה במשך עשרות שנים והחוקרים המשיכו לשנות את הפרוטוקולים הקודמים או ליצור חדשים למטרות שונות7,10,11. השתמשנו בסדרה של בדיקות כדי לנתח באופן מקיף את היעילות וההתקדמות של שלבי הבידול של mESCs לנויר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NIH (1R35GM133496-01) ל- Z. Gao. ברצוננו להודות לד”ר ריאן הובס על הסיוע בחתך. אנו מודים למתקני הליבה של מכללת פן סטייט לרפואה, כולל מדעי הגנום וביואינפורמטיקה, הדמיית מיקרוסקופיה אור מתקדמת, ואת Cytometry הזרימה. אנו מודים גם לד”ר יוקה אימאמורה על הסיוע בניתוח RNA-seq.
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
