Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

El sistema inmunitario innato incluye múltiples tipos celulares que estimulan la activación y la inflamación del complemento. Las células inmunes innatas incluyen células asesinas naturales (NK), mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares, compuestos por monocitos, macrófagos y células dendríticas, se han implicado en la fisiopatología de múltiples afecciones oftálmicas como la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE)^1. En este protocolo, nos centraremos en la identificación de fagocitos mononucleares utilizando análisis citométricos de flujo multiparamétrico en un modelo de ratón de AMD neovascular^2. Este protocolo es adaptable para modelos de ratón de retinopatía diabética y/o uveítis, pero se recomienda una disección ocular más extensa debido a la naturaleza sistémica de estas enfermedades.

Los fagocitos mononucleares expresan marcadores de superficie celular superpuestos. Los macrófagos y microglia residentes en tejidos de larga duración se originan a partir del progenitor eritromicoide derivado del saco de yema^3,mientras que el reciclaje de macrófagos y células dendríticas se diferencian del progenitor de células dendríticas de células dendríticas derivadas de la médula ósea^4. Los marcadores de superficie de celda del ratón comunes a monocitos, macrófagos y celdas dendríticas incluyen CD45, CD11b^5,F4/80^6,Cx3cr1⁷y el marcador intracelular Iba1^8. Con el fin de superar este desafío, el análisis transcriptómico de macrófagos, monocitos y células dendríticas de múltiples tejidos define CD64 como un marcador de superficie celular específico del macrófago⁶. Se han descrito macrófagos en el iris, la coroides, el cuerpo ciliario y el nervio óptico en ojos sanos^3. Alternativamente, la identificación de células dendríticas es más difícil; el método más específico de identificación de células dendríticas requiere mapeo del destino utilizando el ratón reportero Zbtb46-GFP⁹. Independientemente de esta línea de reportero, expresión de CD11c y MHCII en conjunto con la ausencia de CD64 puede identificar posibles células dendríticas^6,10. Las células dendríticas se han identificado en córnea, conjuntiva, iris y coroides en los ojos normales^11. Las microglias son macrófagos especializados ubicados en la retina, protegidos por la barrera hematoencefálica y derivados de las células progenitoras del saco de yema^12. Como resultado, la microglia retiniana se puede diferenciar de los macrófagos derivados de monocitos por sus niveles tenues de la expresión CD45¹³ y los altos niveles de Tmem119, que está disponible como anticuerpo de citometría de flujo^14. Sin embargo, tras la activación de la microglia, el CD45 puede estar regulado¹⁵ y Tmem119 puede estar regulado a la baja^3,lo que demuestra la complejidad de la biología de la microglia y esto es probablemente relevante tanto en AMD como en su modelo de ratón. Por último, los monocitos se pueden dividir en al menos dos subtipos, incluidos los clásicos y no clásicos. Los monocitos clásicos muestran ccr2⁺ly6C^altoCX3CR1^baja expresión, y los monocitos no clásicos demuestran CCR2^–Ly6C^bajoCX3CR1 marcadores^{altos 5}.

Debido a la necesidad del análisis cuantitativo de la expresión de marcadores, es decir, niveles altos frente a bajos/tenues, la citometría de flujo multiparamétrico es el método ideal para la discriminación entre monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en el ojo y otros tejidos. Otras ventajas incluyen la identificación de subpoblaciones, la capacidad de utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para ordenar las poblaciones celulares para el análisis transcriptómico o proteómico, y el mapeo del destino. La principal desventaja de la citometría de flujo multiparametrista es la falta de arquitectura tisular. Esto puede ser superado por la disección oftálmica en los diversos subcompartmentos oculares: córnea, conjuntiva, iris, lente, retina y complejo choroide-sclera. Además, se pueden realizar imágenes confirmatorias de inmunofluorescencia, pero está limitada por el número de marcadores y la falta de cuantificación robusta.

Estudios de asociación del genoma han vinculado múltiples genes complementarios con AMD^16. La activación del complemento conduce a la producción de anafiltoxina, el reclutamiento de leucocitos y la inflamación resultante. En ratones deficientes en receptores complementarios, la lesión láser reduce el reclutamiento de fagocitos mononucleares y la neovascularización coroidal inducida por láser (CNV) área^17. Del mismo modo, el ratón knockout del receptor de quimiocina con motivo C-C 2 (CCR2), que es deficiente en el reclutamiento de monocitos al tejido, demuestra tanto la disminución del reclutamiento de fagocitos mononucleares como el área¹⁸del CNV inducida por láser. Estos enlaces de datos complementan y mononucleares fagocitos con CNV experimental y posiblemente AMD neovascular. En apoyo de esta asociación, los receptores complementarios están disregulados en monocitos sanguíneos periféricos en pacientes con DMM neovascular^19,20. Estos datos demuestran una fuerte asociación entre la AMD y los fagocitos mononucleares.

En este manuscrito, utilizaremos el modelo experimental de CNV inducido por láser para caracterizar las poblaciones mononucleares de fagocitos en el ojo del ratón utilizando citometría de flujo multiparametral. El CNV inducido por láser es el modelo estándar de ratón de la AMD neovascular, que demostró la eficacia de la terapia amd neovascular de primera línea actual^21. Este protocolo describirá la enucleación de los ojos del ratón, la disección ocular, la digestión en una sola suspensión celular, la tinción de anticuerpos, la determinación de voltajes láser utilizando controles de un solo color y la estrategia de gating utilizando controles de fluorescencia menos uno (FMO). Para obtener una descripción detallada del modelo CNV inducido por láser, consulte la publicación^{anterior 22}. Con este protocolo, definiremos microglia, monocitos, células dendríticas y poblaciones de macrófago. Además, utilizaremos MHCII y CD11c para definir aún más subconjuntos de macrófago dentro del modelo CNV inducido por láser.