Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten

Das angeborene Immunsystem umfasst mehrere Zelltypen, die die Komplementaktivierung und Entzündung stimulieren. Angeborene Immunzellen umfassen natürliche Killerzellen (NK) Zellen, Mastzellen, Basophile, Eosinophile, Neutrophile, und mononukleäre Phagozyten. Mononukleare Phagozyten, die aus Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen bestehen, wurden in die Pathophysiologie mehrerer ophthalmologischer Erkrankungen wie Uveitis, diabetische Retinopathie und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)¹verwickelt. In diesem Protokoll werden wir uns auf die Identifizierung mononuklearer Phagozyten mittels multiparameterr Flusszytometrieanalyse in einem Mausmodell der neovaskulären AMD²konzentrieren. Dieses Protokoll ist anpassungsfähig für Mausmodelle der diabetischen Retinopathie und/oder Uveitis, aber eine umfassendere Augensektion wird aufgrund der systemischen Natur dieser Krankheiten empfohlen.

Mononukleare Phagozyten exprimiert überlappende Zelloberflächenmarker. Langlebige Gewebe-Resident-Makrophagen und Mikroglia stammen aus dem aus dem Dottersack abgeleiteten Erythromyeloid-Vorläufer³, während das Recycling von Makrophagen und dendritischen Zellen sich vom Knochenmark-abgeleiteten makrophagenen dendritischen Zellvorläufer⁴unterscheidet. Zu den Mauszelloberflächenmarkern, die Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen gemeinsam sind, gehören CD45, CD11b⁵, F4/80⁶, Cx3cr1⁷und der intrazelluläre Marker Iba1⁸. Um diese Herausforderung zu meistern, definiert die transkriptomische Analyse von Makrophagen, Monozyten und dendritischen Zellen aus mehreren Geweben CD64 als makrophagenspezifischen Zelloberflächenmarker⁶. Makrophagen wurden in der Iris, Der Aderhaut, dem Ziliarkörper und dem Sehnerv in gesunden Augen beschrieben³. Alternativ ist die dendritische Zellidentifikation schwieriger; Die spezifischste Methode der dendritischen Zellidentifikation erfordert eine Schicksalskartierung mit der Zbtb46-GFP-Reportermaus⁹. Unabhängig von dieser Reporterzeile kann die Expression von CD11c und MHCII in Verbindung mit dem Fehlen von CD64 potenzielle dendritische Zellen^6,10identifizieren. Dendritische Zellen wurden in Hornhaut, Bindehaut, Iris und Aderhaut in normalen Augen¹¹identifiziert. Mikroglia sind spezialisierte Makrophagen in der Netzhaut, geschützt durch die Blut-Retina-Barriere, und abgeleitet von Dotter-Sac-Vorläuferzellen¹². Dadurch kann die retinale Mikroglia von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen durch ihre düsteren Konzentrationen von CD45-Expression¹³ und hohen Konzentrationen von Tmem119 unterschieden werden, die als Durchflusszytometrie-Antikörper¹⁴erhältlich sind. Bei der Aktivierung von Mikroglia kann CD45 jedoch¹⁵ und Tmem119 herunterreguliert sein³, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, und dies ist wahrscheinlich sowohl für AMD als auch für sein Mausmodell relevant. Schließlich können Monozyten in mindestens zwei Subtypen unterteilt werden, darunter klassische und nicht-klassische. Klassische Monozyten zeigen CCR2⁺Ly6C^highCX3CR1^Low Expression, und nicht-klassische Monozyten zeigen CCR2^–Ly6C^lowCX3CR1^High Marker⁵.

Aufgrund der Notwendigkeit der quantitativen Analyse der Markerexpression, d.h. hoher im Vergleich zu niedrigen/niedrigen Konzentrationen, ist die Multiparameter-Flow-Zytometrie die ideale Methode zur Diskriminierung zwischen Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritischen Zellen im Auge und anderen Geweben. Weitere Vorteile sind die Identifizierung von Subpopulationen, die Möglichkeit, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur Sortierung von Zellpopulationen für transkriptomische oder proteomische Analysen zu verwenden, und Schicksalskartierung. Der Hauptnachteil der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist der Mangel an Gewebearchitektur. Dies kann durch die ophthalmologische Dissektion in die verschiedenen okulären Subkompartimente überwunden werden: Hornhaut, Bindehaut, Iris, Linse, Netzhaut und Aderhautsklera-Komplex. Darüber hinaus kann eine bestätigende Immunfluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden, ist jedoch durch die Anzahl der Marker und den Mangel an robuster Quantifizierung begrenzt.

Genomweite Assoziationsstudien haben mehrere Komplementgene mit AMD¹⁶verknüpft. Die Komplementaktivierung führt zur Anaphylatoxinproduktion, Zur Rekrutierung von Leukozyten und zu einer daraus resultierenden Entzündung. Bei Komplementrezeptor-Mangelmäusen reduziert die Laserverletzung die mononukleäre Phagozytenrekrutierung und den laserinduzierten choroidalen Neovaskularisationsbereich (CNV)¹⁷. In ähnlicher Weise zeigt die C-C-Motiv-Chemokin-Rezeptor-2 (CCR2)-Knockout-Maus, die einen Mangel an Monozytenrekrutierung im Gewebe hat, sowohl eine verringerte mononukleäre Phagozytenrekrutierung als auch den laserinduzierten CNV-Bereich¹⁸. Diese Daten verbinden Komplement und mononukleäre Phagozyten mit experimenteller CNV und möglicherweise neovaskulärer AMD. Zur Unterstützung dieser Assoziation werden Komplementrezeptoren bei Patienten mit neovaskulärer AMD^19,20. Diese Daten zeigen einen starken Zusammenhang zwischen AMD und mononukleären Phagozyten.

In diesem Manuskript verwenden wir das experimentelle laserinduzierte CNV-Modell, um die mononukleären Phagozytenpopulationen im Mausauge mittels Multiparameter-Flow-Zytometrie zu charakterisieren. Laserinduzierte CNV ist das Standard-Mausmodell der neovaskulären AMD, das die Wirksamkeit der aktuellen ersten linie neovaskulären AMD-Therapie²¹demonstrierte. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation von Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine Einzelzellsuspension, die Antikörperfärbung, die Bestimmung von Laserspannungen mit Einzelfarbsteuerungen und die Gating-Strategie mit Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen. Eine detaillierte Beschreibung des laserinduzierten CNV-Modells finden Sie in einer früheren Publikation²². Mit diesem Protokoll definieren wir Mikroglia, Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagenpopulationen. Darüber hinaus werden wir MHCII und CD11c verwenden, um Makrophagen-Teilmengen innerhalb des laserinduzierten CNV-Modells weiter zu definieren.