Summary

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

Published: June 20, 2020
doi:

Summary

この技術の目的は、肺インフレおよび肺動脈を介した放射線不透明ポリマー系化合物の注入を介した早期出生後および成人マウスの肺動脈ネットワークのex vivo視覚化である。キャストされた組織の潜在的な用途についても議論される。

Abstract

血管は、3次元空間で複雑なネットワークを形成します。その結果、血管ネットワークが組織の表面を観察することによってどのように相互作用し、動作するかを視覚的に理解することは困難である。この方法は、肺の複雑な3次元血管アーキテクチャを可視化する手段を提供する。

これを達成するために、カテーテルが肺動脈に挿入され、脈管構造が同時に血液を洗い流され、化学的に拡張されて抵抗を制限する。肺は、標準的な圧力で気管を通して膨張し、ポリマー化合物は、標準的な流量で血管床に注入されます。動脈ネットワーク全体が満たされて治癒することが許されると、肺血管構造を直接可視化するか、マイクロCT(μCT)スキャナで画像化することができます。

正常に行われると、出生後の早期から成人までのマウスの肺動脈ネットワークを理解することができる。さらに、肺動脈床で実証されている間、この方法は、最適化されたカテーテルの配置およびエンドポイントを有する任意の血管床に適用することができる。

Introduction

この技術の焦点は、マウスにおけるポリマー系化合物を用いた肺動脈アーキテクチャの可視化である。脳、心臓、腎臓,,11、2、3、4、5などの全身血管床に関する広範な作業が行われてきたが、肺動脈ネットワークの準備および充填に関する情報は少ない。,2,345したがって、この研究の目的は、前の研究66、7、87,8に拡大し、調査官が肺動脈樹の高解像度画像を生成するために簡単に従うことができる詳細な書面および視覚的な参照を提供することである。

磁気共鳴画像、心エコー検査、CT血管造影,9、10など、肺血管構造の標識やイメージングには数多くの方法がありますが、これらのモダ9リティの多くは小さな血管を十分に充填および/または捕獲できず、研究できる範囲を制限しています。シリアル断面化や再構築などの方法は、高解像度を提供しますが、時間/労働集約型11、12、13です。,12,13従来の腐食鋳造,,10、13、14、15、16で、軟部組織の完全性を取り巻く妥協がある。10,13,141516動物の年齢や大きさでさえ、カテーテルを導入しようとするときに、または、解像度が欠けている要因になります。一方、ポリマー注入技術は、動脈を毛細管レベルまで満たし、μCTと組み合わせると、比類ない分解能5を可能にする。出生後14日目の若いマウス肺からのサンプルは、8に正常にキャストされ、数時間で処理されました。これらは、無期限に再スキャンすることも、既存の軟組織17を損なうことなく組織学的準備/電子顕微鏡(EM)のために送ることさえできる。この方法の主な制限は、CT機器/ソフトウェアの先行コスト、血管内圧を正確に監視する課題、および同じ動物の中で縦方向にデータを取得できないことです。

この論文は、肺動脈注射技術をさらに最適化し、年齢/サイズ関連の境界を出生後1日目(P1)に押し下げて顕著な結果を生み出す既存の作業に基づいています。動脈血管ネットワークを研究したいチームにとって最も有用です。したがって、カテーテルの配置/安定化、フィルレート/ボリュームの制御の強化、鋳造成功の増加に対する注目すべき落とし穴のハイライトに関する新しいガイダンスを提供します。その結果、結果のキャストを将来の特性評価と形態解析に使用できます。おそらくもっと重要なのは、これは私たちの知る限りでは、この複雑な手順をユーザーに説明する最初の視覚的なデモンストレーションです。

Protocol

ここに記載されているすべての方法は、国立心臓肺血液研究所の施設動物のケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています。 1. 準備 ヘパリン(1単位/gマウス体重)で腹腔内にマウスを注入し、2分間アンブレートさせます。 CO2チャンバーで動物を安2楽死させる。 外科用基板の上の上の上の上の位置にマウスを配置し、テープでボードにす?…

Representative Results

成功したキャストは、肺動脈ネットワーク全体の均一な充填を示します。これは、C57Bl/6Jマウスの年齢に及ぶ:出生後の日P90(図4A)、P30(図4B)、P7(図4C)、およびP1(図4D)でこれを実証する。Figure 4C流量を制御し、リアルタイムで充填を監視することで、最も遠位血管系の信頼性の高い?…

Discussion

適切に実行され、この方法は、げっ歯類モデルの比較と実験を可能にする肺動脈ネットワークの印象的な画像を生成します。いくつかの重要なステップは、成功を保証します。まず、研究者は、肺血管系および心臓のチャンバーに血栓が形成されるのを防ぐために、準備段階で動物をヘパリン化する必要があります。これはポリマー化合物の完全な動脈輸送を可能にする。第二に、横隔膜を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NHLBIイントラムラル研究プログラム(DIR HL-006247)によって部分的に支援されました。画像の取得と解析に関する指導を受け、NIHマウスイメージング施設に感謝申し上げます。

Materials

1cc syringe Becton Dickinson 309659
20ml Glass Scintillation Vials Fisher 03-340-25P
30G Needle Becton Dickinson 305106
50mL conical tubes Cornin 352098 For sample Storage and scanning
60cc syringe Becton Dickinson 309653
7-0 silk suture Teleflex 103-S
Analyze 12.0 Software AnalyzeDirect Inc. N/A Primary Software
Amira 6.7 Software Thermo Scientific N/A Alternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cm Fine Science tools 14958-09
Ceramic Coated Curved Forceps Fine Science tools 11272-50
CO2 Tank Robert's Oxygen Co. n/a
Dual syringe pump Cole Parmer EW-74900-10
Dumont Mini-Forceps Fine Science tools 11200-14
Ethanol Pharmco 111000200
Formalin Sigma – Life Sciences HT501128
Gauze Covidien 441215
Hemostat Fine Science tools 13013-14
Heparin (1000USP Units/ml) Hospira NDC 0409-2720-01
Horos Software Horos Project N/A Alternative Sofware
induction chamber n/a n/a
Kimwipe Fisher 06-666 fiber optic cleaning wipe
Labelling Tape Fisher 15966
Magnetic Base Kanetec N/A
Micro-CT system SkyScan  1172
Microfil (Polymer Compound) Flowech Inc. Kit B – MV-122 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
Micromanipulator Stoelting 56131
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe Covidien 1188528012
Octagon Forceps Straight Teeth Fine Science tools 11042-08
Parafilm Bemis company, Inc. #PM999
PE-10 tubing Instech BTPE-10
Phospahte buffered Saline BioRad #161-0780
Ring Stand Fisher S13747 Height 24in.
Sodium Nitroprusside sigma 71778-25G
Steel Plate N/A N/A 16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring Scissors Fine Science tools 15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter Santa Cruz Biotechnology 360103
Surgical Board Fisher 12-587-20 This is a converted slide holder
Universal 3-prong clamp Fisher S24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing Nipro PR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope Zeiss n/a

References

  1. Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
  2. Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
  3. Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
  4. Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
  5. Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
  6. Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
  7. Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
  8. Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
  9. Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
  10. Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
  11. Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
  12. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  13. Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
  14. Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
  15. Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
  16. Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), 521-548 (1993).
  17. Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
  18. Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
  19. Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
  20. Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer’s disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
  21. Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
  22. Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
  23. Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
  24. Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
  25. Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
  26. Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
  27. Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
  28. Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
  29. Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
  30. Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
  31. Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
  32. Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
  33. Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
  34. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  35. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  36. Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
  37. Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
  38. Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
  39. Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
  40. Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
  41. Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
  42. Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
  43. Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
  44. Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
  45. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  46. Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
  47. Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).

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Knutsen, R. H., Gober, L. M., Sukinik, J. R., Donahue, D. R., Kronquist, E. K., Levin, M. D., McLean, S. E., Kozel, B. A. Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61242, doi:10.3791/61242 (2020).

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