יציקת כלי דם של ריאות עכבר מבוגר ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיית מיקרו-CT
Summary
המטרה של טכניקה זו היא הדמיה ex vivo של רשתות עורקים ריאתיים של עכברים פוסט לידתיים ומבוגרים מוקדם באמצעות אינפלציה ריאות והזרקה של תרכובת פולימר אטומה רדיו באמצעות עורק הריאה. יישומים פוטנציאליים עבור רקמות יצוקות נדונים גם.
Abstract
כלי דם יוצרים רשתות מורכבות בחלל תלת מימדי. כתוצאה מכך, קשה להעריך חזותית כיצד רשתות כלי דם אינטראקציה ולהתנהג על ידי התבוננות על פני השטח של רקמה. שיטה זו מספקת אמצעי לדמיין את ארכיטקטורת כלי הדם התלת מימדית המורכבת של הריאה.
כדי להשיג זאת, צנתר מוכנס לתוך עורק הריאה ואת כלי הדם הוא שטף בו זמנית של דם ומורחב כימית כדי להגביל את ההתנגדות. הריאות מתנפחות לאחר מכן דרך קנה הנשימה בלחץ סטנדרטי, תרכובת הפולימר חדורת לתוך מיטת כלי הדם בקצב זרימה סטנדרטי. לאחר כל רשת העורקים מתמלאת ומותר לרפא, כלי הדם של הריאות עשוי להיות חזותי ישירות או בתמונה על סורק מיקרו CT (μCT).
כאשר מבוצע בהצלחה, אפשר להעריך את רשת עורקים ריאתי בעכברים החל בגילים שלאחר הלידה מוקדם למבוגרים. בנוסף, בעוד הפגינו במיטת עורקים ריאתי, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מיטה כלי דם עם מיקום צנתר אופטימיזציה ונקודות קצה.
Introduction
המוקד של טכניקה זו הוא הדמיה של ארכיטקטורת עורקים ריאתי באמצעות תרכובת פולימר מבוסס בעכברים. בעוד עבודה נרחבת בוצעה על מיטות כלי דם מערכתיות כגון מוח, לב, וכליה1,,2,,3,,4,,5 , פחות מידעזמיןלגבי הכנה ומילוי של רשת עורקים ריאתית. מטרת מחקר זה, אם כן, היא להרחיב עלעבודה קודמת 6,7,8ולספק התייחסות כתובהוחזותית מפורטת כי החוקרים יכולים בקלות לעקוב כדי לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה של עץ עורקי הריאה.
בעוד שיטות רבות קיימות עבור תיוג והדמיה כלי דם ריאות, כגון הדמיית תהודה מגנטית, אקוקרדיוגרפיה, או ANgiography CT9,10, רבים של שיטות אלה להיכשל למלא כראוי ו / או ללכוד את כלי קטן, הגבלת היקף מה ניתן ללמוד. שיטות כגון מקטעים טוריים ושחזור מספקים רזולוציה גבוהה אך הם זמן / עבודהאינטנסיבית 11,12,13. שלמות הרקמה הרכה שמסביב נפגעת בליהוק קורוזיהמסורתי 10,,13,,14,,15,,16. אפילו גיל וגודל בעלי חיים הופכים לגורמים כאשר מנסים להציג צנתר או, הרזולוציה היא חסרה. טכניקת הזרקת פולימר, מצד שני, ממלאת עורקים לרמת ניים ובשילוב עם μCT, מאפשרת רזולוציה שאין שני לה5. דגימות מריאות העכבר צעיר כמו יום לאחר הלידה 14 כבר יצוק בהצלחה8 ומעובד בעניין של שעות. אלה ניתן לסרוק מחדש ללא הגבלת זמן, או אפילו נשלח למיקרוסקופי הכנה היסטולוגית / אלקטרונים (EM) מבלי להתפשר על הרקמה הרכה הקיימת17. המגבלות העיקריות לשיטה זו הן העלות מראש של ציוד/תוכנה CT, אתגרים עם ניטור מדויק של לחץ תוך-וסקולרי, ועם חוסר היכולת לרכוש נתונים באופן אורכי באותה חיה.
נייר זה מתבסס על עבודה קיימת כדי לייעל עוד יותר את טכניקת הזרקת עורק הריאה ולדחוף את הגבולות הקשורים לגיל/גודל עד ליום שלאחר הלידה 1 (P1) כדי להניב תוצאות מרשימות. זה שימושי ביותר עבור צוותים שרוצים ללמוד רשתות כלי דם עורקיים. בהתאם לכך, אנו מספקים הדרכה חדשה למיקום/ייצוב של צנתר, שליטה מוגברת על קצב מילוי/נפח, ומדגישים חסרונות בולטים להצלחה מוגברת בליהוק. לאחר מכן ניתן להשתמש בשחקנים כתוצאה מכך לאפיון עתידי וניתוח מורפורולוגי. אולי חשוב מכך, זוהי ההדגמה החזותית הראשונה, למיטב ידיעתנו, שהולכת את המשתמש בהליך המורכב הזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו, המבוצעת כראוי, מניבה תמונות מרשימות של רשתות עורקים ריאתיות, ומאפשרת השוואה וניסויים במודלים של מכרסמים. מספר צעדים קריטיים לאורך הדרך מבטיחים הצלחה. ראשית, על החוקרים לתפור את החיה בשלב ההכנה כדי למנוע מקרישי דם להיווצר בכלי הדם הריאות ותאי הלב. זה מאפשר את המעבר העורקי המלא של תר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר התוך-תוך-ממורלית של NHLBI (DIR HL-006247). ברצוננו להודות למתקן ההדמיה של עכבר NIH על הדרכה ברכישת תמונה וניתוח.
Materials
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma – Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | SkyScan | 1172 | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B – MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer’s disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
