该协议允许将人类多能细胞分化为肠道类器官。该协议通过将细胞分化为确定的内胚层,后肠内胚层和肠上皮细胞群来模拟正常的人类发育。这使得该协议适用于研究肠道发育和疾病建模应用。
hiPSC 衍生的肠道类器官是上皮结构,可从分化的细胞自组装成复杂的 3D 结构,代表人类肠上皮,其中它们表现出隐窝/绒毛样结构。在这里,我们描述了通过将 hiPSC 逐步分化为最终内胚层来生成 hiPSC 衍生的肠道类器官,然后在转移到 3D 培养条件之前将其后部化以形成后肠上皮。3D 培养环境由补充有 SB202190、A83-01、Gastrin、Noggin、EGF、R-spondin-1 和 CHIR99021 的细胞外基质 (ECM)(例如 Matrigel 或其他相容的 ECM)组成。类器官每 7 天进行一次传代,在转移到新鲜的细胞外基质并使其扩增之前,它们被机械破坏。QPCR和免疫细胞化学证实,hiPSC来源的肠道类器官含有成熟的肠上皮细胞类型,包括杯状细胞、潘氏细胞和肠细胞。此外,类器官通过表达位于上皮细胞顶端表面的绒毛显示出极化的证据。
由此产生的类器官可用于模拟人类肠道发育以及包括炎症性肠病在内的多种人类肠道疾病。为了模拟肠道炎症,类器官可以暴露于炎症介质,如TNF-α、TGF-β和细菌LPS。暴露于促炎细胞因子的类器官表现出炎症和纤维化表型作为反应。将源自 IBD 患者的健康 PSC 与 hiPSC 配对可能有助于了解驱动 IBD 的机制。这可能会揭示新的治疗靶点和新的生物标志物,以帮助早期疾病诊断。
多能干细胞 (PSC) 的特性,例如自我更新和分化为人体任何细胞类型的能力,使其成为发育、疾病病理学和药物测试研究的宝贵工具1.人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 对于疾病建模研究特别有用,因为它们可以来源于患者,直接捕获导致疾病表型 2,3 的基因组。这种 hiPSC 可以分化为受遗传缺陷影响的细胞类型,从而可以仔细检查疾病的分子机制4。
人 PSC 的分化方案旨在通过激活或抑制控制谱系承诺和规范的特定信号通路来指导细胞在主要发育阶段的分化。将 hiPSC 维持在多能状态需要中等水平的激活素 A (Act-A) 信号转导,而高剂量的 Act-A 持续 3 天可使 hiPSC 达到最终的内胚层 (DE) 命运 5,6。Act-A 和 Wnt 通路直接 DE 的前后身份。Act-A 的信号转导诱导前肠 (FG) 标志物,如 HHEX、HNF4α 和 GATA4,同时阻断后肠 (HG) 基因(如 CDX2)的表达。Wnt 信号转导诱导 DE 的后置化,然后采用 HG 基因表达谱 7,8。一旦确定了HG细胞身份,就可以将分化从2D转移到3D,并引导到肠道类器官的形成。
肠道类器官通常在基于 3D 细胞外基质(例如,Matrigel 或其他相容的 ECM)的培养系统9 中培养,该系统由层粘连蛋白、胶原蛋白 IV 和肌动蛋白组成,并富含生长因子,如 EGF、FGF、PDGF 和 IGF-1,有助于支持存活和增殖。类器官在含有 Gastrin、Noggin 和 CHIR 的特定培养基中培养,以在长期培养过程中刺激和支持肠道干细胞的生长和增殖。
肠上皮细胞嵌入细胞外基质后,肠隐窝开始形成并扩大,最终形成球状体。这些成熟为模拟肠上皮生理功能的类器官结构。类器官通常可以培养 1 年以上,而不会显着损失功能和基因表达谱。每周需要传代,使用酶消化将类器官消化成更小的片段,然后自我重组成完整的类器官。
已建立的类器官系可用作与肠道相关的多种疾病的可靠模型,包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和结直肠癌10、11、12、13。这是动物细胞的首选模型,因为它们表达与这些疾病相关的人类基因,并且对外部刺激的反应更接近于体内人体组织中发生的刺激。
在这里,我们描述了将人类多能细胞分化为人类肠道类器官的方案。我们证明了它们用于研究炎症;然而,这可以应用于各种环境,并与CRISPR / Cas9基因编辑方法14相结合,适用于任何遗传背景。一旦分化,按照确定性内胚层、后肠内胚层和肠上皮的自然发育分化序列,所得类器官可以连续培养和传代超过 12 个月。
该协议的一个关键方面是内胚层分化之前未分化干细胞的初始铺板密度。如果这没有得到充分优化,细胞可能会在最初的DE分化步骤中死亡(如果细胞太稀疏)或降低DE分化的效率(如果细胞太密集)。正确的起始密度需要针对所使用的细胞系进行优化,正确的密度应在 DE D3 结束时生成单层。应使用流式细胞术来确定 DE 规格的效率,我们通常会看到 >80% 的细胞对 SOX17 和/或 CXCR4 呈阳性。当 SOX17 阳性细胞数量少于 60% 时,HG 图案化的效率受到影响,这导致转移到细胞外基质时形成的类器官较少。这最终将导致所得的类器官培养失败。为了确定 DE 到 HG 的模式化是否成功,我们通过流式细胞术评估 CDX2 阳性细胞的数量,通常期望看到 >80% 的阳性细胞。同样,如果 CDX2 阳性细胞的数量低于 50%,这将对转移到 3D 细胞外基质培养时产生的肠道类器官的数量产生不利影响。
将 2D 单层转移到 3D 培养物中后,转印后 24-48 小时应出现小的致密球体。根据所用细胞系的分化效率,可能会出现大片死细胞。我们不是立即传代培养物以去除这些碎片,而是让类器官完全形成并发展其更复杂的折叠结构。等待 7-10 天后再尝试第一次通过,确保存在足够的分裂细胞来产生许多新的肠道类器官。在传代过程中,通过以足够的速度缓慢旋转分离的类器官/碎片混合物,可以很容易地去除培养物中仍然存在的任何碎片,以沉淀类器官,但使细胞片漂浮在培养基中。然后可以吸出培养基和细胞碎片,以便只留下类器官颗粒。
这种方法的局限性在于,hiPSC衍生的细胞类型在基因表达和功能谱方面通常不完全成熟。为了确定 hiPSC 来源的肠道组织是否适合特定应用,应表征不同细胞类型的类器官,包括肠细胞 (VIL)、肠内分泌细胞 (neurog3)、杯状细胞 (MUC2)、瞬时扩增细胞 (CD133)、潘氏细胞 (FZD5) 和 LGR5+ 干细胞 (LGR5),以确定类器官细胞组成。
总体而言,与许多其他类器官分化方案相比,该方案的主要优势在于,由于用小分子替换了几种重组蛋白和条件培养基制备物,因此该培养平台非常具有成本效益15,16。分化为HG非常简单和快速,可以应用于人类胚胎和诱导多能干细胞,具有相同的结果。当严格跟踪并针对正在使用的细胞系进行优化时,它提供了一个相对简单的模型平台,没有污染间充质细胞,然后可以应用于研究各种情况下的肠上皮,包括炎症、宿主病原体相互作用7.通过提供促纤维化刺激,然后通过QPCR、蛋白质印迹和ELISA评估胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质蛋白的表达,可以研究肠道纤维化建模。在分化之前对未分化的干细胞系使用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以创建基因敲除或蛋白质过表达类器官,这些类器官可用于创建疾病特异性类器官和更复杂的疾病模型 14,17,18。
The authors have nothing to disclose.
NH 由 MRC (MR/S009930/1) 和 Wellcome Trust (204267/Z/16/Z) 资助,PD 由 MRC PhD DTP 资助,KLF 由 BBSRC iCASE 资助。
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Activin A | R&D | 338-AC | |
Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
SB202190 | Tocris | 1264 | |
TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
Wnt 3a | R&D | 5036-WN |