발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

알림: 아래에 자세히 설명된 모든 조직 배양 작업은 클래스 II 층류 후드에서 수행해야 합니다. 1. 후장 내배엽에 대한 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 분화 세포 배양 플라스크를 세포외 기질로 코팅하려면 먼저 필요한 기질의 양을 계산합니다. 다음은 Matrigel로 코팅된 12웰 플레이트의 예입니다. 12웰 플레이트를 코팅하는 데 필요한 세포외 기질의 양을 계산합니다. 다음 공식을 사용합니다.참고: 선택한 세포외 기질로 세포 배양 접시를 코팅합니다. Matrigel을 사용하는 경우 분화를 위해 파종 2 24시간 전에 0.035mg/cm2 24시간의 농도를 사용하십시오. 제품 시트에서 세포외 기질의 배치 농도를 확인하고 제조업체의 지침에 따라 실험에 앞서 더 작은 부분 표본을 준비합니다. p1000 피펫을 사용하여 차가운 DMEM 배지에 필요한 양의 세포외 기질을 희석합니다. 5mL 스트리펫을 사용하여 잘 섞는다. 각 웰 플레이트에 500μL의 희석된 매트릭스를 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 희석된 세포외 기질을 고르게 분포시키고 37°C에서 최소 12시간 동안 배양합니다. 플레이트에 세포를 파종하기 전에 500μL의 PBS로 각각을 잘 세척하여 과도한 세포외 기질을 제거합니다. 이렇게 하면 분화 중에 세포가 분리되는 것을 방지할 수 있습니다. 세포외 기질의 건조를 방지하기 위해 씨를 뿌릴 준비가 될 때까지 우물에 마지막 세척을 그대로 두십시오. 최종 내배엽(DE) 또는 후배엽(HG)에 대한 hiPSC 분화를 위해 시드하려면 선택한 유지 배지(예: 필수 8 배지)에서 배양된 hiPSC 플라스크를 취하고 배지를 흡입합니다. (여기서는 25,000 cells/cm2로 세포를 시드합니다.)참고: 파종 밀도는 성공적인 분화에 매우 중요하며 각 개별 hiPSC 세포주에 맞게 최적화해야 합니다. 플라스크의 세포를 5mL의 PBS로 세척합니다. PBS를 흡인합니다. 2.5mL의 세포 해리 용액(예: TrypLE)을 넣고 상온에서 4분 동안 그대로 둡니다. 세포 해리 용액을 흡인하고 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 분리합니다. 37°C로 예열한 5mL의 DMEM 배지로 플라스크를 세척하고 모든 세포를 15mL 튜브에 수집합니다. 10μL의 재현탁 세포 용액을 가지고 혈구계로 세포 밀도를 측정합니다. 세포 현탁액을 충분히 취하여 1.05 x 106 세포를 수집하고 15mL 튜브에 넣습니다. 160 x g 에서 3분 동안 회전합니다. 세포가 원심분리되는 동안 세포외 기질로 코팅된 12웰 플레이트에서 PBS를 흡입합니다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 ROCK 억제제(10μM)를 사용하여 12mL의 유지 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. p1000 피펫을 사용하여 12웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 셀 현탁액을 추가합니다. 웰 사이에 균등한 분포를 보장하기 위해 세포를 잘 재현탁합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 플레이트의 웰 내에 세포를 분산시키되 웰 중앙에 세포가 집중되므로 매체의 소용돌이를 피하십시오. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다. 파종 후 24시간 후에 미디어를 유지 관리 미디어(예: 필수 8 미디어)로만 교체합니다(ROCK 억제제 없음). DE로의 분화를 시작하려면 표 1에 따라 내배엽 기저 배지를 준비합니다.참고: 분화 시작 시 세포는 60-80% 합류 지점에 있어야 합니다. 내배엽 기저 배지에 Activin A(100ng/mL) 및 Wnt3(50ng/mL)를 추가하여 12mL의 DE 배지를 준비합니다. 미디어를 37°C로 예열합니다. 조직 배양 플레이트 또는 플라스크의 각 웰에서 배지를 흡입합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 DE 배지를 추가하여 DE 분화를 시작합니다. DE 분화(D1 DE)를 시작한 후 24시간이 지나면 새 DE 배지를 준비하고 배지 교환을 수행합니다. 1.24시간(D48 DE)에서 2단계를 반복합니다. 이 단계에서 세포 사멸이 많이 발생하면 배지 교체 전에 500μL의 PBS로 모든 웰을 세척하십시오.참고: 성공적인 내배엽 분화를 확인하려면 유세포 분석을 수행하여 SOX17의 발현을 평가하십시오. 우리는 일반적으로 세포의 >80%가 D3 DE에 의해 SOX17 양성이 될 것으로 예상합니다. SOX17의 발현이 최적이 아닌 경우 세포 파종 밀도와 Act-A의 농도를 최적화해야 합니다. 이 시점, 즉 DE 분화 시작 후 72시간 후에 HG 분화를 시작합니다. 내배엽 기저 배지에 CHIR99021(3μM) 및 RA(1μM)를 추가하여 HG 배지 12mL를 준비합니다(표 1).참고: D3 DE에서 셀은 균일한 단층을 형성해야 합니다. 최적의 DE 분화는 추가 분화 단계에 매우 중요합니다. DE 배지를 흡입합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 HG 배지를 추가하여 HG 분화를 시작합니다. 매일 미디어를 교체하면서 4일 동안 차별화를 계속합니다.참고: DE 사후화의 성공 여부를 확인하려면 유세포 분석을 수행하여 CDX2의 발현을 평가하십시오. HG 분화의 D4에 의해 우리는 일반적으로 세포의 >80%가 CDX2 양성이 될 것으로 예상합니다. 사후화가 차선책인 경우 CHIR99021의 집중을 최적화해야 합니다. RNA 추출을 위한 샘플을 수집하려면 분화 배지를 흡인하고 500ul의 PBS로 웰을 세척합니다. PBS를 흡인하고 RNA 추출 키트에서 적절한 양의 세포 용해 완충액을 추가합니다. p1000 피펫을 사용하여 웰 바닥을 긁어 모든 세포가 용해되도록 합니다. 세포 용해물을 흡인하고 깨끗한 튜브에 넣습니다. RNA 추출을 진행하거나 RNA 추출이 준비될 때까지 -20°C에서 용해물을 동결합니다. 면역염색의 경우 분화 배지를 흡입하고 500μL의 PBS로 웰을 세척합니다. PBS를 흡입하고 500μL의 4% PFA를 추가합니다.참고: PFA는 독성이 있습니다. 적절한 PPE를 사용하고 PFA 폐기를 위한 현지 실험실 절차를 따르십시오. 4 °C에서 20 분 동안 배양합니다. PFA를 제거하고 500μL의 PBS로 웰을 세 번 세척합니다. 면역염색을 수행할 준비가 될 때까지 세포에 마지막 PBS 세척을 그대로 둡니다. 2. 장내 오가노이드의 노화 표 2에 따라 장 기초 배지를 준비합니다. 2D에서 3D 세포 배양으로 전환하려면 6웰 플레이트를 사용하여 hiPSCS에서 DE 세포를 생성합니다. 5mL 스트리펫을 사용하여 6 cell plate를 형성하는 세포의 단층을 분리합니다. 세포를 15mL 원심분리 튜브에 모은 후 400 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 생성합니다. SB202190(10μM), A83-01(500nM), 가스트린(10nM), 노긴(100ng/μL), EGF(500ng/μL), R-Spondin1(100ng/mL), CHIR99021(6μM), ROCK 억제제(10μM)와 같은 성장 인자를 포함하는 장 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 도금되는 웰의 수에 따라 적절한 부피의 세포외 기질을 추가합니다. 이것은 아래 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다.[1] 세포외 기질/배지의 총 부피(μL) = 30μL * 48웰 플레이트의 웰 수[2] 세포외 기질의 필요 부피 (μL) = [1]의 답변 * 2/3[3] 필요한 매체 부피 (μL) = [1]의 답 * 1/3 30 μL의 셀 현탁액을 48웰 플레이트의 각 웰 중앙에 추가합니다. 세포외 기질이 굳을 수 있도록 37°C 인큐베이터에서 최소 5분 동안 플레이트를 배양합니다. 세포외 기질 돔이 굳으면 모든 성장 인자를 포함하는 300μL의 장 성장 배지를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 5%CO2가 있는 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.알림: 48시간 후에도 오가노이드가 관찰되지 않거나 상당한 세포 사멸이 있는 경우 ROCKi 및 NOGGIN 농도를 최적화해야 할 수 있습니다. 오가노이드를 통과시키려면 광학 현미경으로 세포를 관찰하여 오가노이드의 밀도와 크기를 평가하고 통과가 필요한지 여부를 결정합니다. 세포 배양 배지를 얼음처럼 차가운 PBS로 교체합니다.참고: 오가노이드 배양은 약 5-7일마다 분할해야 합니다. 장내 오가노이드 배양물의 패시징은 오가노이드 내강 내에 세포 파편이 축적되고 주변 장 성장 배지가 황변되면 필요합니다. 5mL 스트리펫으로 긁는 동작을 사용하여 플레이트에서 오가노이드와 세포외 기질 구체를 기계적으로 분리합니다. 각 웰의 오가노이드를 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 오가노이드를 펠트하기 위해 400 x g 에서 1분 동안 오가노이드 현탁액을 원심분리합니다. 세포 펠릿의 상단에 도달할 때까지 상층액을 흡인하고 눈에 보이는 세포외 기질층에 도달할 때 주의하십시오. 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS 15mL에 재현탁시킵니다.알림: 이 단계는 초기 스핀에서 제거되지 않은 남아 있는 세포외 기질을 세척하는 역할을 합니다. 400 x g 에서 1분 동안 원심분리기 오가노이드가 포함된 펠릿까지 배지를 흡인합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 1mL에 재현탁합니다. p200 피펫을 사용하여 위아래로 여러 번 피펫팅하여 온전한 오가노이드를 수동으로 파괴합니다.알림: 광학 현미경을 사용하여 오가노이드의 크기를 관찰하여 추가 해리가 필요한지 여부를 결정합니다. 성장 인자 없이 배지 9mL를 추가합니다. 400 x g 에서 1분 동안 원심분리기 오가노이드가 펠릿이 될 때까지 상층액을 흡인합니다. 아래 방정식을 사용하여 필요한 세포외 기질 및 배지의 양을 계산합니다.[1] 세포외 기질/배지의 총 부피(μL) = 30μL * 48웰 플레이트의 웰 수[2] 세포외 기질의 필요 부피 (μL) = [1]의 답변 * 2/3[3] 필요한 매체 부피 (μL) = [1]의 답 * 1/3 성장 인자 (Noggin & ROCK 억제제 포함)가있는 장 배지의 계산 된 부피에 오가노이드 펠릿을 재현탁시킵니다. 이 세포 현탁액에 필요한 양의 세포외 기질을 추가하고 재현탁하여 오가노이드의 균일한 분포를 보장합니다. 이 현탁액 30μL를 48웰 플레이트의 각 웰 중앙에 피펫팅합니다(바람직하게는 37°C 인큐베이터에서 예열). 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣고 세포외 기질이 굳을 때까지 5분 동안 기다립니다. 성장 인자(+ ROCK 억제제)가 있는 장 배지를 준비합니다(48웰 플레이트당 약 17mL). 각 웰에 300μL를 추가합니다. 37 °C에서 5 % CO2 로 배양합니다. 패시에이징 후 장내 오가노이드에 대한 배지를 흡인하고 2-4일마다 성장 인자(Noggin & ROCK 억제제 제외)가 있는 신선한 장 배지로 교체합니다.알림: 48시간 후에도 오가노이드가 관찰되지 않거나 상당한 세포 사멸이 있는 경우 ROCKi 및 NOGGIN 농도를 최적화해야 할 수 있습니다.참고: 장내 오가노이드는 in vivo에서 다양한 염증 매개체에 반응합니다. TNFα는 여러 염증 과정에 관여하는 세포 신호 전달 단백질입니다. 장내 오가노이드에서 염증 반응을 유발하려면 기저 배지에만 40ng/mL 농도로 TNFα를 준비합니다. 48웰 플레이트에서 매체를 흡입합니다. 40ng/mL TNFα를 함유한 준비된 기초 배지 300μL를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 배양하여 염증 유발 환경을 재현합니다.참고: 장내 오가노이드는 in vivo에서 다양한 염증 매개체에 반응합니다. TNFα는 여러 염증 과정에 관여하는 세포 신호 전달 단백질입니다. 흡인으로 남은 세포를 5% Trigene이 포함된 진공 트랩에 폐기합니다.