Denne protokol beskriver en Aspergillus infektion model i zebrafisk larver. Aspergillus sporer er microinjected i baghjernen af larver, og kemisk behandling bruges til at fremkalde immunosuppression. Infektionsprogression overvåges via en daglig billeddannelsesopsætning for at overvåge svampevækst og immunrespons samt optælling af levende sporer ved kolonidannelsesenhed, der plating.
Invasiv aspergillosis (IA) er en af de mest almindelige svampeinfektioner blandt immunkompromitterede individer. På trods af tilgængeligheden af svampemidler kan IA forårsage > 50% dødelighed hos inficerede immunkompromitterede patienter. Det er afgørende at bestemme både værts- og patogenfaktorer, der bidrager til infektionsfølsomhed og lave overlevelsesrater hos inficerede patienter for at udvikle nye behandlingsfaktorer. Medfødte immunrespons spiller en central rolle i anerkendelse og clearance af Aspergillus sporer, men lidt er kendt om den nøjagtige cellulære og molekylære mekanismer. Pålidelige modeller er nødvendige for at undersøge detaljerede mekanistiske interaktioner mellem værten og patogenet. Zebrafisklarvers optiske klarhed og genetiske tarmkanal gør dem til en spændende model til at studere værtspatogeninteraktioner af flere menneskelige bakterie- og svampeinfektioner i en levende og intakt vært. Denne protokol beskriver en larve zebrafisk Aspergillus infektion model. For det første isoleres Aspergillus sporer og injiceres i zebrafisk hindbrain ventrikel via mikroinjection. Derefter tilsættes kemiske hæmmere som immunosuppressive lægemidler direkte til larvevandet. To metoder til overvågning af infektionen i injicerede larver er beskrevet, herunder 1) homogenisering af larver til kolonidannelsesenhed (CFU) optælling og 2) en gentagen, daglig levende billeddannelsesopsætning. Samlet set kan disse teknikker bruges til mekanistisk at analysere udviklingen af Aspergillus-infektion in vivo og kan anvendes på forskellige værtsbaggrunde og Aspergillus-stammer for at afhøre værtspatogeninteraktioner.
Aspergillus fumigatus er en allestedsnærværende saprofytisk svamp, og dens luftbårne sporer kan findes både indendørs og udendørs1. Disse sporer indåndes af alle , men bliver effektivt fjernet fra lungerne hos immun inkompetente individer1,2. Men, mennesker med ændrede lungesygdomme såsom cystisk fibrose kan udvikle bronchopulmonary aspergillosis på grund af svampespiring i lungerne3. Den mest alvorlige form for denne infektion, invasiv aspergillosis (IA), påvirker immunkompromitterede individer og involverer vækst af svampen i andre organer2,3. IA fører til >50% død af inficerede patienter på trods af tilgængeligheden af anti-svampe behandlinger4. Hos immunkompetente individer spiller medfødte immunresponser en stor rolle i rydningen af de inhalerede sporer1. De specifikke mekanismer, der bidrager til denne medfødte immunrydning, er imidlertid ikke godt forstået. Det er vigtigt at forstå de cellulære og molekylære mekanismer i større medfødte immunceller (dvs. makrofager og neutrofiler) i clearance af Aspergillus for at finde nye terapeutiske strategier for IA.
Mens pattedyr modeller har været medvirkende til at identificere svampe virulens faktorer og vært immunrespons5,6, visuel tilgængelighed er begrænset til vært-patogen interaktioner på cellulært niveau. Vævskulturforsøg kan ikke fuldt ud opsummere det komplekse multicellulære miljø og interaktioner, der findes i hele dyr7. Derfor har zebrafisk vundet popularitet som en alternativ modelorganisme til at udfylde dette hul og lette undersøgelsen af værtspatogeninteraktioner i en levende, intakt vært på tværs af en flerdages infektion8,9. Zebrafisken medfødt immunsystem udvikler sig så tidligt som 24 timer efter befrugtning (hpf)10, og det adaptive system tager 4-6 uger at udvikle11, hvilket giver et vindue af tid, hvor medfødte immunresponser kan vurderes isoleret. Medfødte immunrespons er godt bevaret mellem mennesker og zebrafisk11. Zebrafisk har mange kvaliteter, der letter undersøgelsen af disse reaktioner, herunder optisk klarhed (som giver mulighed for høj opløsning levende billeddannelse af intakte værter) og genetiske tractability (som letter molekylære mekanistiske undersøgelser).
Larve zebrafisk Aspergillus infektion model beskrevet her blev oprindeligt udviklet af Knox et al.12. Det er for nylig blevet udvidet af vores gruppe og andre til at undersøge vært immunmekanismer12,13, host-patogen interaktioner13,14,15, mekanismer immunosuppression13,16,17, svampe virulens18, og anti-svampe lægemiddel effekt19,20. Denne model opsummerer flere aspekter af menneskelig aspergillosis. Mens immunkompetente larver er resistente, kan immunkompromitterede larver bukke under for infektion12,13,16,17.
I denne model etableres en lokaliseret infektion ved at injicere sporer i larvenens hindbrain ventrikel, et område mindre befolket med fagocytter, og phagocyt rekruttering og adfærd kan evalueres12,13. Det antages, at makrofager fungerer som den første forsvarslinje mod Aspergillus sporer hos mennesker1 og pattedyrsmodeller6,21. Tilsvarende rekrutteres makrofager i zebrafiskmodellen til de injicerede Aspergillus sporer, mens neutrofiler rekrutteres sekundært som reaktion på hypnotisal vækst12,13,22. Fra denne model er det også blevet lært, at Aspergillus kan fortsætte i vilde type immunkompetente larver efter mere end 7 dages infektion. Desuden kan hele infektionsforløbet følges i de samme levende dyr ved daglig konfokal billeddannelse.
Denne protokol beskriver teknikken med mikroinjection til at injicere sporer i hindbrain ventrikel af 2 dage efter befrugtning (2 dpf) larver. Infektionen overvåges derefter i op til 7 dage, da zebrafisklarver kan leve op til 10 dpf uden fodring. Immunosuppression kan induceres ved lægemiddelbehandling, og anvendelsen af lægemidler til larverne beskrives også. Endelig beskrives to metoder til at følge infektionsprogression, herunder kvantificering af CFU’er fra individuelle larver og en daglig live imaging-opsætning.
Infektionsmodellen, der er beskrevet her, er gavnlig til analyse af værtens immunrespons, værtspatogeninteraktioner og svampepatogenese12,13,14,15. Disse oplysninger kan udledes af høj opløsning billeddannelse af fluorescerende-mærkede patogener og værtsceller13, larve overlevelse, og CFU persistens over tid.
Mikroinjection teknikken er afgørende for succes i denne protokol og kan være nødvendigt at justere, når du bruger forskellige mikroinjection udstyr og opsætninger. Især er trykket og tidspunktet for injektionen to store variabler og kan justeres for at sikre, at det volumen, der skubbes ud af nålen, er ~ 3 nL. Nålens størrelse som bestemt ved at klippe den med pincet regulerer også antallet af sporer, der injiceres; selv om en større åbning kan forårsage vævsskader på larven. På den anden side vil for lille en åbning ikke tillade de relativt store sporer (>2 μm) ud og kan føre til nålestop. Hvis dette sker, kan nålen reclipped at have en lidt større åbning.
Andre protokoller for mikroinjection af bakterier bruger PVP-40 til at hjælpe med at opretholde en homogen injektionsblanding, men vi har ikke fundet nogen fordel ved at bruge denne bærer med Aspergillus sporer. Tilstopning af nålen kan afbødes ved at hvirvle svampeforberedelsen grundigt for at bryde eventuelle klumper, før du lægger nålen. Nogle gange kan en tilstopning i nålen også løsnes ved midlertidigt at øge trykket eller injektionstiden og udløse mikroinjektoren, mens nålen er i væsken omkring larverne. Tryk- og injektionstiden skal derefter reduceres igen til tidligere niveauer. I andre tilfælde kan en træsko ikke fjernes, og en ny nål skal indlæses og kalibreres igen.
Denne protokol er designet til at injicere ~30-70 sporer pr. larve. Det er kendt, at baseret på koncentrationen af sporepræparatet og det injicerede volumen er dette tal ret lavt. Det er imidlertid empirisk konstateret, at dette er antallet af sporer, der injiceres under disse forhold. Hvorfor denne forskel opstår, er ukendt, men det kan skyldes spore klumper i nålen. Vores egne forsøg på at injicere et større antal sporer har stort set været forgæves.
For at sikre, at omkring 30-70 sporer injiceres og opretholder konsistensen af injektionerne i alle larverne, skal du kontrollere antallet af sporer ved at injicere på E3 omkring larverne. Gentag dette hver fem til seks larver gennem alle injektioner. Hvis sporantal synes at ændre sig, kan tryk- og/eller injektionstiden justeres for at injicere et ensartet antal sporer på tværs af flere larver. Det skal dog sørges for, at injektionsdosis forbliver primært i baghjernen og ikke fylder mellem- og forhjernen.
For at sikre en lokaliseret infektion skal sporeaffjedringen være indeholdt i baghjernens ventrikel. Dette kan visualiseres ved phenol rød farvning lige efter injektionen, selv om den røde farve diffunderer med tiden. Til injektioner anvendes regionen omkring otic vesikel til at gennembore og nå hjertekammeret i en vinkel på 45°-65°. Dette område har ingen vigtigste blodkar, forårsager mindre vævsskader, og heler øjeblikkeligt. Hvis huden over hjertekammer er gennemboret, spore suspension kan lækkes ud, fordi nålen, der skal bruges til Aspergillus spore injektioner er større end den, der bruges til bakterielle suspensioner. Forgæves injicerede eller utilsigtet beskadigede larver kan markeres ved at injicere i æggeblommen et par gange for at skabe et rødt mærke eller ved at trække larven ud af rækken med nålen. Når et sæt injektioner er afsluttet, skal disse larver fjernes og bortskaffes, før resten vaskes af pladen. E3 uden methylenblåt bruges til at bedøve larver før injektion og også holde larven efter injektionerne, fordi methylenblåt er anti-svampe.
På injektionstidspunktet repræsenterer CFU-tællinger antallet af levedygtige sporer i den inficerede vært. Men hvis sporerne spirer til hyphae, kan disse opdeles i separate levedygtige “svampeenheder” under homogenisering og kan give anledning til flere kolonier. Eller en ubrudt flercellet hypha kan give anledning til en enkelt koloni, hvilket resulterer i en gennemsnitlig, men upræcis, repræsentation af svampebyrden. Dette kan afbødes ved at kombinere CFU-tællingerne med langsgående mikroskopi af individuelle larver, som giver visuelle data om skæbnen for injicerede sporer.
Sammenlignet med pattedyrssystemet er zebrafisk larveinfektionsmodellen særlig vigtig på grund af dens optiske tilgængelighed. Rekruttering og reaktion af medfødte immunceller kan visualiseres i en levende intakt vært. Dette kan indarbejdes med genetisk eller kemisk hæmning af molekylære mål for at analysere, hvordan hvert mål påvirker makrofaget eller neutrofil reaktion mod Aspergillus sporer i et levende dyr.
Mens zebrafisk larve Aspergillus infektion model fortsætter med at være medvirkende til at beskrive forskellige aspekter af IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, der er andre områder af ekspansion. Fra værtssiden bruges det til at beskrive immunrespons på cellulært niveau, men dette kan udvides til at analysere immunmekanismer på molekylært niveau ved at kombinere det med målrettet morfolino, CRISPR, stabile mutantlinjer eller kemisk eksponering. En advarsel er, at homologer for alle kendte pattedyr medfødte immunvej komponenter ikke er blevet identificeret i zebrafisk.
Fra patogensiden er virulens af forskellige arter og stammer blevet beskrevet. En lovende vej for fremtidig forskning er brugen af mutante Aspergillus-stammer til at teste, hvordan specifikke gener eller proteiner bidrager som virulensfaktorer. Derved kan nye svampemedicin udvikles til at målrette disse proteiner. Nuværende anti-svampe medicin har lav effekt hos menneskelige patienter, og der er stigende resistens over for disse lægemidler hos svampe28. Denne in vivo model kan bruges til at undersøge, hvorfor disse lægemidler mislykkes, og som en mellemliggende model til at teste effekten af nye anti-svampe medicin. Samlet set kan resultaterne opdaget ved hjælp af denne model lette den fremtidige udvikling af effektive behandlinger for Aspergillus-inficeredepatienter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Allergy and Infectious Diseases fra National Institutes of Health under Award Number K22AI134677. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |