عدوى يرقات حمار وحشي مع جراثيم أسبيرغيلوس لتحليل التفاعلات المضيفة الممرضة
Summary
يصف هذا البروتوكول نموذج عدوى أسبيرغيلوس في يرقات حمار وحشي. يتم حقن جراثيم أسبيرغيلوس في الدماغ الخلفي لليرقات ، ويستخدم العلاج الكيميائي للحث على كبت المناعة. يتم رصد تطور العدوى عن طريق إعداد التصوير اليومي لمراقبة النمو الفطري والاستجابات المناعية وكذلك تعداد الجراثيم الحية عن طريق طلاء وحدة تشكيل المستعمرة.
Abstract
داء الرشاشيات الغازي (IA) هو واحد من العدوى الفطرية الأكثر شيوعا بين الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. على الرغم من توافر الأدوية المضادة للفطريات، يمكن أن يسبب IA >50٪ وفيات في المرضى المصابين بناه نقص المناعة. ومن الأهمية بمكان تحديد العوامل المضيفة ومسببات الأمراض التي تسهم في قابلية العدوى وانخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة لدى المرضى المصابين من أجل تطوير علاجات جديدة. تلعب الاستجابات المناعية الفطرية دورا محوريا في التعرف على جراثيم Aspergillus وإزالتها ، على الرغم من أنه لا يعرف الكثير عن الآليات الخلوية والجزيئية الدقيقة. ويلزم وجود نماذج موثوقة للتحقيق في التفاعلات الميكانيكية التفصيلية بين المضيف ومسببات الأمراض. الوضوح البصري وقابلية المسالك الوراثية ليرقات حمار وحشي جعلها نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة التفاعلات المضيفة الممرضة لعدة التهابات بكتيرية وفطرية بشرية في مضيف حي وسليم. يصف هذا البروتوكول نموذج عدوى حمار وحشي يرقي Aspergillus. أولا، يتم عزل جراثيم أسبيرغيلوس وحقنها في البطين الخلفي لسمك الحمار الوحشي عن طريق الحقن الدقيق. ثم تضاف مثبطات كيميائية مثل الأدوية المثبطة للمناعة مباشرة إلى ماء اليرقات. يتم وصف طريقتين لرصد العدوى في اليرقات المحقونة ، بما في ذلك 1) تجانس اليرقات لتعداد وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) و 2) إعداد تصوير حي يومي متكرر. وعموما، يمكن استخدام هذه التقنيات لتحليل ميكانيكيا تطور عدوى أسبيرغيلوس في الجسم الحي ويمكن تطبيقها على خلفيات المضيف المختلفة وسلالات أسبيرغيلوس لاستجواب التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض.
Introduction
أسبرجريلوس fumigatus هو الفطريات saprophytic في كل مكان، ويمكن العثور على جراثيم المحمولة جوا على حد سواء في الداخل والخارج1. يتم استنشاق هذه الجراثيم من قبل الجميع ولكن تصبح واضحة بشكل فعال من رئتي الأفراد من ذوي القدرة المناعية1،2. ومع ذلك ، يمكن للأشخاص الذين يعانون من أمراض الرئة المتغيرة مثل التليف الكيسي تطوير داء الرشاشيات القصبي الرئوي بسبب الإنبات الفطري في الرئتين3. الشكل الأكثر شدة من هذه العدوى، داء الرشاشيات الغازية (IA)، ويؤثر على الأفراد منقوص المناعة وينطوي على نمو الفطريات في أجهزة أخرى2،3. IA يؤدي إلى وفاة >50٪ من المرضى المصابين على الرغم من توافر العلاجات المضادة للفطريات4. في الأفراد المنافسين للمناعة ، تلعب الاستجابات المناعية الفطرية دورا رئيسيا في إزالة الجراثيم المستنشقة1. ومع ذلك ، فإن الآليات المحددة التي تساهم في هذا التطهير المناعي الفطري ليست مفهومة جيدا. من المهم فهم الآليات الخلوية والجزيئية للخلايا المناعية الفطرية الرئيسية (أي الضامة والنيوتروفيليا) في إزالة أسبيرغيلوس من أجل العثور على استراتيجيات علاجية جديدة لIA.
في حين أن نماذج الثدييات كانت مفيدة في تحديد عوامل الفوعة الفطرية والاستجابات المناعيةالمضيفة 5،6، فإن إمكانية الوصول البصري محدودة للتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض على المستوى الخلوي. لا يمكن لتجارب زراعة الأنسجة أن تلخص بشكل كامل البيئة المعقدة متعددة الخلايا والتفاعلات الموجودة في بأكملها7. لذلك ، اكتسبت حمار وحشي شعبية ككائن حي نموذجي بديل لسد هذه الفجوة وتسهيل دراسة التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض في مضيف حي سليم عبر عدوى متعددة الأيام8،9. يتطور الجهاز المناعي الفطري لسمك الحمار الوحشي في وقت مبكر من 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf)10، ويستغرق النظام التكيفي 4-6 أسابيع لتطوير11، مما يوفر نافذة من الوقت يمكن فيها تقييم الاستجابات المناعية الفطرية بمعزل عن غيرها. يتم الحفاظ على الاستجابات المناعية الفطرية بشكل جيد بين البشر وسمك الحمار الوحشي11. وسمك الحمار الوحشي له العديد من الصفات التي تسهل التحقيق في هذه الاستجابات، بما في ذلك الوضوح البصري (الذي يسمح بالتصوير الحي عالي الدقة للمضيفين السليمين) وقابلية المسالك الوراثية (مما يسهل الدراسات الميكانيكية الجزيئية).
تم تطوير نموذج عدوى حمار وحشي اليرقات Aspergillus الموصوف هنا في الأصل من قبل نوكسوآخرون. وقد تم مؤخرا توسيعه من قبل مجموعتنا وغيرها للتحقيق في الآليات المناعيةالمضيفة 12،13، التفاعلات المضيفةالممرضة 13،14،15، آليات كبت المناعة13،16،17، الفوعة الفطرية18، وفعالية الدواء المضاد للفطريات19،20. يلخص هذا النموذج جوانب متعددة من داء الرشاشيات البشري. في حين أن اليرقات المناعية مقاومة ، يمكن أن تستسلم اليرقات المنافرة للعدوى12و13و16و17.
في هذا النموذج ، يتم إنشاء عدوى موضعية عن طريق حقن الجراثيم في البطين الخلفي لليرقة ، وهي منطقة أقل اكتظاظا بالخلايا الفرجية ، ويمكن تقييم تجنيد الخلايا الفرجية وسلوكها12،13. ويعتقد أن الضامة بمثابة خط الدفاع الأول ضد جراثيم أسبيرغيلوس في البشر1 والثدييات نماذج6،21. وبالمثل ، في نموذج حمار وحشي ، يتم تجنيد الضامة إلى جراثيم Aspergillus المحقونة ، في حين يتم تجنيد العدلات بشكل ثانوي استجابة لنمو الواصلة12و13و22. من هذا النموذج ، تم أيضا معرفة أن Aspergillus يمكن أن يستمر في يرقات الأنواع البرية المناعية بعد أكثر من 7 أيام من العدوى. وعلاوة على ذلك ، يمكن اتباع مسار العدوى بأكمله في نفس الحيوانات الحية عن طريق التصوير البؤري اليومي.
يصف هذا البروتوكول تقنية الحقن المجهري لحقن الجراثيم في البطين الخلفي لمدة يومين بعد الإخصاب (2 dpf) اليرقات. ثم يتم رصد العدوى لمدة تصل إلى 7 أيام ، حيث يمكن أن تعيش يرقات حمار وحشي حتى 10 ديسبف دون تغذية. يمكن أن يسبب العلاج من المخدرات كبت المناعة ، كما يتم وصف تطبيق الأدوية على اليرقات. وأخيرا، يتم وصف طريقتين لمتابعة تطور العدوى، بما في ذلك تحديد كمي ل CFUs من اليرقات الفردية وإعداد التصوير الحي اليومي.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج العدوى الموصوف هنا مفيد لتحليل الاستجابات المناعية المضيفة ، والتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض ، ومسببات الأمراض الفطرية12،13،14،15. يمكن استخلاص هذه المعلومات من التصوير عالي الدقة لمسببات الأمراض ذات العلامات الفلورية والخلايا المضيفة13، وبقاء اليرقات ، واستمرار CFU بمرور الوقت.
تقنية التجميل الدقيق أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول، وقد تحتاج إلى تعديل عند استخدام معدات وأجهزة مختلفة للتحريج الدقيق. على وجه الخصوص، والضغط والوقت من الحقن هما المتغيرات الرئيسية ويمكن تعديلها لضمان أن حجم قذف بواسطة الإبرة هو ~ 3 nL. حجم الإبرة كما يحددها قص مع ملقط ينظم أيضا عدد الجراثيم التي يتم حقنها. على الرغم من أن فتحة أكبر يمكن أن تسبب تلف الأنسجة لليرقة. من ناحية أخرى، فإن صغيرة جدا من فتحة لا تسمح الجراثيم كبيرة نسبيا (>2 ميكرومتر) من ويمكن أن يؤدي إلى انسداد إبرة. إذا حدث هذا، يمكن أن تكون إبرة reclipped أن يكون لها فتحة أكبر قليلا.
بروتوكولات أخرى للميكروجينجيكون البكتيريا الاستفادة PVP-40 للمساعدة في الحفاظ على خليط حقن متجانسة، ولكن لم نجد أي ميزة في استخدام هذا الناقل مع جراثيم أسبيرغيلوس. انسداد الإبرة يمكن التخفيف من دوامة إعداد الفطرية تماما لكسر أي كتل قبل تحميل الإبرة. في بعض الأحيان ، يمكن أيضا خلع تسد في الإبرة عن طريق زيادة الضغط أو وقت الحقن مؤقتا وحفز الحقن الدقيق أثناء وجود الإبرة في السائل المحيط باليرقات. ثم ينبغي أن ينخفض الضغط وحقن مرة أخرى إلى المستويات السابقة. في حالات أخرى، لا يمكن إزالة تسد، وإبرة جديدة تحتاج إلى تحميل وإعادة معايرة.
تم تصميم هذا البروتوكول لحقن ~ 30-70 جراثيم لكل يرقة. ومن المعروف أنه استنادا إلى تركيز إعداد بوغ وحجم حقن، وهذا العدد منخفض جدا. ومع ذلك ، فقد وجد تجريبيا أن هذا هو عدد الجراثيم التي تم حقنها في ظل هذه الظروف. لماذا يحدث هذا الاختلاف غير معروف، ولكن قد يكون بسبب تكتل بوغ في الإبرة. محاولاتنا الخاصة لحقن أعداد أكبر من الجراثيم كانت فاشلة إلى حد كبير.
لضمان حقن حوالي 30-70 جراثيم والحفاظ على اتساق الحقن في جميع اليرقات ، تحقق من عدد الجراثيم عن طريق الحقن على E3 المحيطة باليرقات. كرر هذا كل خمس إلى ست يرقات في جميع الحقن. إذا كان عدد بوغ يبدو أن التغيير، يمكن تعديل الضغط و / أو حقن الوقت لحقن عدد ثابت من الجراثيم عبر يرقات متعددة. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر من أن جرعة الحقن لا تزال في المقام الأول في الدماغ الخلفي ولا تملأ الدماغ المتوسط والماء.
لضمان العدوى الموضعية، يجب احتواء تعليق البوغ داخل البطين الخلفي. ويمكن تصور هذا من قبل تلطيخ الأحمر الفينول فقط بعد الحقن، على الرغم من أن اللون الأحمر ينتشر مع مرور الوقت. بالنسبة للحقن، يتم استخدام المنطقة المحيطة بالحويصلة الصوتية لاختراق البطين والوصول إليه بزاوية 45 درجة إلى 65 درجة. هذه المنطقة ليس لديها الأوعية الدموية الرئيسية، ويسبب أقل تلف الأنسجة، ويشفي على الفور. إذا تم ثقب الجلد فوق البطين، يمكن تسريب تعليق بوغ، لأن الإبرة التي يجب أن تستخدم لحقن بوغ أسبيرغيلوس أكبر من ذلك يستخدم للتعليق البكتيري. يمكن وضع علامة على اليرقات التي تم حقنها أو تلفها عن طريق الخطأ عن طريق الحقن في الصفار عدة مرات لإنشاء علامة حمراء أو عن طريق سحب اليرقة من الصف باستخدام الإبرة. بعد اكتمال مجموعة من الحقن ، يجب إزالة هذه اليرقات والتخلص منها قبل غسل الباقي من الطبق. يستخدم E3 بدون أزرق الميثيلين لتخدير اليرقات قبل الحقن وأيضا الحفاظ على اليرقات بعد الحقن ، لأن أزرق الميثيلين مضاد للفطريات.
في وقت الحقن ، تمثل أعداد CFU عدد الجراثيم القابلة للحياة داخل المضيف المصاب. ومع ذلك ، إذا انبتت الجراثيم إلى هيفاي ، يمكن تقسيمها إلى “وحدات فطرية” منفصلة قابلة للحياة أثناء التجانس ويمكن أن تؤدي إلى مستعمرات متعددة. أو، يمكن أن يؤدي الغشاء البهيج المتعدد الخلايا غير المنقطع إلى ظهور مستعمرة واحدة، مما يؤدي إلى تمثيل متوسط، ولكن غير دقيق، للعبء الفطري. ويمكن التخفيف من ذلك من خلال الجمع بين تعداد CFU مع المجهر الطولي لليرقات الفردية ، والذي يوفر بيانات بصرية عن مصير الجراثيم المحقونة.
بالمقارنة مع نظام الثدييات ، فإن نموذج عدوى يرقات الحمار الوحشي مهم بشكل خاص بسبب إمكانية الوصول البصري إليه. يمكن تصور تجنيد واستجابة الخلايا المناعية الفطرية داخل مضيف حي سليم. ويمكن دمج ذلك مع تثبيط الوراثية أو الكيميائية من الأهداف الجزيئية لتحليل كيف يؤثر كل هدف على الماكروفيج أو رد فعل العدلات ضد جراثيم أسبيرغيلوس في حي.
في حين أن نموذج عدوى يرقات الحمار الوحشي Aspergillus لا يزال مفيدا في وصف جوانب مختلفة من IA12و13و14و15و16و17و18و19و20و22، فهناك مجالات أخرى للتوسع. من الجانب المضيف ، يتم استخدامه لوصف الاستجابات المناعية على المستوى الخلوي ، ولكن يمكن توسيع هذا لتحليل آليات المناعة على المستوى الجزيئي من خلال الجمع بينه وبين مورفولينو المستهدف ، CRISPR ، خطوط متحولة مستقرة ، أو التعرض الكيميائي. تحذير واحد هو أن المتجانسات لجميع مكونات المسار المناعي الفطرية الثدييات المعروفة لم يتم تحديدها في حمار وحشي.
من جانب مسببات الأمراض ، تم وصف ضراوة الأنواع والسلالات المختلفة. وهناك سبيل واعد للبحوث في المستقبل هو استخدام سلالات أسبيرغيلوس المتحولة لاختبار كيفية مساهمة جينات أو بروتينات محددة كعوامل فحولة. وبالتالي ، يمكن تطوير أدوية جديدة مضادة للفطريات لاستهداف هذه البروتينات. الأدوية المضادة للفطريات الحالية لها فعالية منخفضة في المرضى البشر وهناك مقاومة متزايدة لهذه الأدوية في الفطريات28. يمكن استخدام هذا النموذج في الجسم الحي للتحقيق في سبب فشل هذه الأدوية وكنموذج وسيط لاختبار فعالية الأدوية المضادة للفطريات الجديدة. وعموما، يمكن للنتائج المكتشفة باستخدام هذا النموذج تسهيل التطوير المستقبلي للعلاجات الفعالة للمرضى المصابين ب Aspergillus.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم K22AI134677. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
- Denning, D. W. Invasive aspergillosis. Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
