该协议描述了斑马鱼幼虫的 阿斯珀吉勒斯 感染模型。 孢 子被微注入幼虫的后脑,化学处理用于诱导免疫抑制。感染进展通过每日成像设置进行监测,以监测真菌生长和免疫反应,以及通过菌落形成单位电镀来列举活孢子。
侵入性阿斯珀吉尔病 (IA) 是免疫功能低下个体中最常见的真菌感染之一。尽管有抗真菌药物,IA 仍可导致受感染免疫功能低下患者>50% 的死亡率。必须确定导致感染患者感染易感性和低存活率的宿主和病原体因素,以便开发新的治疗方法。与生俱来的免疫反应在识别和清除 阿斯珀吉卢斯 孢子方面起着关键作用,尽管对确切的细胞和分子机制知之甚少。需要可靠的模型来调查宿主和病原体之间的详细机械相互作用。斑马鱼幼虫的光学清晰度和遗传可控性使其成为研究活体和完整宿主中多种人类细菌和真菌感染宿主-病原体相互作用的有趣模型。该协议描述了幼虫斑马鱼 阿斯珀吉卢斯 感染模型。首先, 阿斯珀吉卢斯 孢子被隔离,并通过微注射注射到斑马鱼后脑心室。然后,免疫抑制药物等化学抑制剂直接加入幼虫水中。描述了两种监测注射幼虫感染的方法,包括1)幼虫的同质化,用于结肠形成单位(CFU)的列举和2)重复的每日活成像设置。总的来说,这些技术可用于机械地分析 体内阿斯珀吉卢斯 感染的进展,并可应用于不同的宿主背景和 阿斯珀吉卢斯 菌株,以询问宿主-病原体相互作用。
阿斯珀吉勒斯富米加图斯是一种无处不在的预防性真菌,其空气中的孢子可以在室内和室外找到1。这些孢子被每个人吸入,但成为有效地清除从免疫能力的人的肺1,2。然而,肺部疾病改变的人,如囊性纤维化,可以发展支气管肺结节病,由于真菌发芽在肺3。这种感染最严重的形式,侵入性阿斯珀吉尔病(IA),影响免疫功能不全的个人,并涉及真菌生长到其他器官2,3。IA导致感染患者>50%的死亡,尽管有抗真菌疗法4。在免疫能力强的个体中,与生俱来的免疫反应在清除吸入的孢子1方面起着重要作用。然而,促造成这种与生俱来的免疫清除的具体机制没有得到很好的理解。重要的是要了解主要与生俱来的免疫细胞(即巨噬细胞和嗜中性粒细胞)在清除阿斯珀吉卢斯的细胞和分子机制,以找到新的治疗策略的IA。
虽然哺乳动物模型在识别真菌毒性因素和宿主免疫反应5,6方面发挥了重要作用,但视觉可及性在细胞层面的宿主-病原体相互作用是有限的。组织培养实验不能完全回顾整个动物中存在的复杂多细胞环境和相互作用。因此,斑马鱼作为替代模型生物体越来越受欢迎,以填补这一空白,并有助于研究宿主-病原体相互作用在活的,完整的宿主跨越多日感染8,9。斑马鱼与生俱来的免疫系统最早在受精后(hpf)10小时发育,适应系统需要4-6周才能发育11,这为天生免疫反应提供了隔离评估的时间窗口。人类和斑马鱼之间天生免疫反应保存良好。斑马鱼有许多品质,有助于研究这些反应,包括光学清晰度(允许高分辨率活成像完整的宿主)和遗传可传感(这有利于分子机械学研究)。
这里描述的幼虫斑马鱼阿斯珀吉卢斯感染模型最初是由诺克斯等人开发的。我们小组等人最近扩大调查宿主免疫机制12、13、宿主与病原体相互作用13、14、15、免疫抑制机制13、16、17、真菌毒性18及抗真菌药物疗效19、20。该模型概括了人类性肺病的多个方面。虽然免疫功能幼虫具有抗药性,但免疫功能低下的幼虫可能死于感染12、13、16、17。
在这个模型中,通过将孢子注射到幼虫的后脑心室(一个幼虫人口较少的区域)建立局部感染,噬菌体的招募和行为可以评估12,13。据认为,巨噬细胞是对抗人类1号和哺乳动物模型6号、21号孢子的第一道防线。同样,在斑马鱼模型中,巨噬细胞被招募到注射的阿斯珀吉卢斯孢子中,而嗜中性粒细胞则被招募到第二位,以响应连字符生长12、13、22。从这个模型中,还了解到,阿斯珀吉勒斯在感染超过7天后,可以坚持野生型免疫能力幼虫。此外,通过每日共焦成像,可以跟踪同一活体动物感染的整个过程。
该协议描述了微注射技术,将孢子注射到受精后2天的后脑心室(2 dpf)幼虫。然后对感染进行长达7天的监测,因为斑马鱼幼虫无需喂养即可存活至10分法夫。免疫抑制可以通过药物治疗诱发,并且也描述了药物对幼虫的应用。最后,描述了两种跟踪感染进展的方法,包括从单个幼虫中对CFUs进行量化和每日实时成像设置。
这里描述的感染模型有利于分析宿主免疫反应,宿主-病原体相互作用,真菌发病原体12,13,14,15。这些信息可以从荧光标签病原体和宿主细胞13的高分辨率成像,幼虫生存和CFU的持久性随着时间的推移。
微注射技术对于本协议的成功至关重要,在使用不同的微投影设备和设置时可能需要调整。特别是,压力和注射时间是两个主要变量,可以调整,以确保针头喷出的体积为~3 nL。用钳子剪断针头所决定的针头大小也调节注射孢子的数量:虽然,一个更大的开口可能会导致组织损伤的幼虫。另一方面,开口太小不会允许相对较大的孢子(>2 μm)出来,并可能导致针头堵塞。如果发生这种情况,针头可以重新倾斜,以有一个稍大的开口。
细菌微注入的其他协议使用PVP-40来帮助维持同质注射混合物,但我们没有发现使用这种载体与 阿斯珀吉卢斯 孢子的任何优势。通过在加载针头之前彻底漩涡真菌准备以打破任何团块,可以减轻针头的堵塞。有时,针头中的堵塞也可以通过暂时增加压力或注射时间并触发微注射器来驱散,而针头在幼虫周围的液体中。然后,压力和注射时间应再次降低到以前的水平。在其他情况下,无法去除堵塞,需要加载和重新校准新针头。
此协议旨在向幼虫注射约 30~70 孢子。据了解,根据孢子制备的浓度和注入的体积,这个数字是相当低的。然而,经验发现,这是在这些条件下注射的孢子的数量。为什么会发生这种差异是未知的,但它可能是由于孢子团块在针。我们自己注射更多孢子的尝试基本上没有成功。
为了确保注射约30-70孢子,并保持所有幼虫注射的一致性,请通过注射到幼虫周围的E3来检查孢子的数量。在所有的注射过程中,每五到六个幼虫重复一次。如果孢子计数似乎发生变化,可以调整压力和/或注射时间,在多个幼虫中注入一致数量的孢子。然而,应小心,注射剂量仍然主要在后脑,不填补中脑和前脑。
为了确保局部感染,孢子悬浮应包含在后脑心室内。这可以通过注射后出现苯酚红色染色来可视化,尽管红色会随着时间而扩散。对于注射,otic囊泡周围的区域用于以45°+65°角穿透并到达心室。这个区域没有主血管,造成较少的组织损伤,并立即愈合。如果心室上的皮肤被刺穿,孢子悬架可以泄漏出来,因为用于 阿斯珀吉卢斯 孢子注射的针头大于用于细菌悬浮的针头。注射或意外损坏的幼虫可以通过注射到蛋黄中几次以创建红色标记或用针将幼虫拖出行来标记。注射完成后,这些幼虫应在将其余幼虫从盘子中冲走之前将其移除和处置。E3无甲基蓝用于在注射前给幼虫麻醉,注射后还保留幼虫,因为甲基蓝是抗真菌的。
在注射时,CFU 计数表示受感染宿主体内可行孢子的数量。然而,如果孢子发芽成催眠,这些孢子可以在同质化过程中被分解成独立的可行”真菌单位”,并可能导致多个殖民地。或者,一个不间断的多细胞催眠可以产生一个单一的菌落,导致真菌负担的平均,但不精确的表示。通过将CFU计数与单个幼虫的纵向显微镜相结合,可以减轻这种情况,后者提供了注射孢子命运的可视数据。
与哺乳动物系统相比,斑马鱼幼虫感染模型由于其光学可访问性而显得尤为显著。与生俱来的免疫细胞的招募和反应可以在一个完整无缺的活宿主中可视化。这可以与分子靶点的遗传或化学抑制结合,以分析每个靶点如何影响活体动物对 阿斯珀吉勒斯 孢子的巨噬细胞或中性粒细胞反应。
虽然斑马鱼幼虫阿斯珀吉卢斯感染模型继续有助于描述IA12、13、14、15、16、17、18、19、20、22的不同方面,但还有其他扩展领域。从主机方面,它用于描述细胞水平免疫反应,但可以通过将其与靶向变形金刚、CRISPR、稳定的突变线或化学暴露相结合来扩展以分析分子水平的免疫机制。一个警告是,斑马鱼尚未发现所有已知哺乳动物与生俱来的免疫通路成分的同名。
从病原体方面,描述了不同物种和菌株的毒性。未来研究的一个很有希望的途径是使用突变的 阿斯珀吉卢斯 菌株来测试特定基因或蛋白质如何作为毒性因素起作用。因此,可以开发出针对这些蛋白质的新型抗真菌药物。目前的抗真菌药物对人体患者的疗效较低,真菌28对这些药物的耐药性也越来越大。这种体内模型可用于研究这些药物失败的原因,并作为测试新型抗真菌药物疗效的中间模型。总的来说,使用这种模型发现的发现可以促进阿斯 珀吉勒斯感染患者的有效治疗的未来发展。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持,奖励编号为K22AI134677。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |