Bu protokol zebra balığı larvalarında bir Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. Aspergillus sporları larvaların arka beyinlerine mikroenjeksiyona sokuldu ve immünosupresyona neden olmak için kimyasal tedavi kullanıldı. Enfeksiyon ilerlemesi, mantar büyümesini ve immün yanıtları ve canlı sporların koloni oluşturan birim kaplama ile numaralandırılmasını izlemek için günlük görüntüleme kurulumu ile izlenir.
İnvaziv aspergillosis (IA), bağışıklık sistemi baskılanmış bireyler arasında en sık görülen mantar enfeksiyonlarından biridir. Antifungal ilaçların mevcudiyetine rağmen, IA enfekte immün sistemi baskılanmış hastalarda% 50′> mortaliteye neden olabilir. Yeni terapötikler geliştirmek için enfekte hastalarda enfeksiyon duyarlılığına ve düşük sağkalım oranlarına katkıda bulunan hem konak hem de patojen faktörlerinin belirlenmesi çok önemlidir. Doğuştan gelen immün yanıtlar, Aspergillus sporlarının tanınmasında ve temizlenmesinde önemli bir rol oynar, ancak tam hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Konakçı ve patojen arasındaki ayrıntılı mekanistik etkileşimleri araştırmak için güvenilir modeller gereklidir. Zebra balığı larvalarının optik netliği ve genetik çekiş kabiliyeti, onları canlı ve sağlam bir konakta birden fazla insan bakteriyel ve mantar enfeksiyonunun konak-patojen etkileşimlerini incelemek için ilgi çekici bir model haline getirir. Bu protokol larva zebra balığı Aspergillus enfeksiyon modelini açıklar. İlk olarak, Aspergillus sporları izole edilir ve mikroenjeksiyon yoluyla zebra balığı arka beyin ventrikül içine enjekte edilir. Daha sonra, immünsüpresif ilaçlar gibi kimyasal inhibitörler doğrudan larva suyuna eklenir. Enjekte edilen larvalarda enfeksiyonu izlemek için iki yöntem tanımlanmıştır, 1) koloni oluşturma ünitesi (CFU) numaralandırması için larvaların homojenizasyonu ve 2) tekrarlanan, günlük canlı görüntüleme kurulumu. Genel olarak, bu teknikler in vivo Aspergillus enfeksiyonunun ilerlemesini mekanistik olarak analiz etmek için kullanılabilir ve konak-patojen etkileşimlerini sorgulamak için farklı konak arka planlarına ve Aspergillus suşlarına uygulanabilir.
Aspergillus fumigatus her yerde bulunan bir saprofitik mantardır ve havadaki sporları hem iç hem de dış mekanlarda bulunabilir1. Bu sporlar herkes tarafından solunur, ancak bağışıklık yetersiz bireylerin akciğerlerinden etkili bir şekilde temizlenir1,2. Bununla birlikte, kistik fibrozis gibi akciğer rahatsızlıkları değişmiş olan kişilerde akciğerlerde mantar çimlenmesine bağlı bronkopulmoner aspergillosis gelişebilir3. Bu enfeksiyonun en şiddetli formu olan invaziv aspergillosis (IA), bağışıklık sistemi baskılanmış bireyleri etkiler ve mantarın diğer organlara büyümesini içerir2,3. IA, mantar karşıtı tedavilerin mevcudiyetine rağmen enfekte hastaların%50′>ölümüne yol açar 4 . İmmün yetinsiz bireylerde doğuştan gelen immün yanıtlar solunan sporların temizlenmesinde önemli rol oynar1. Bununla birlikte, bu doğuştan gelen bağışıklık boşluğuna katkıda bulunan spesifik mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. IA için yeni terapötik stratejiler bulmak için Aspergillus’un temizlenmesinde ana doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin (yani makrofajların ve nötrofillerin) hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak önemlidir.
Memeli modelleri mantar virülans faktörlerinin tanımlanmasında etkili olmuş ve immün yanıtları barındırırken5,6, hücresel düzeyde konak-patojen etkileşimleri için görsel erişilebilirlik sınırlıdır. Doku kültürü deneyleri, tüm hayvanlarda var olan karmaşık çok hücreli ortamı ve etkileşimleri tam olarak nüksedemez7. Bu nedenle, zebra balığı bu boşluğu doldurmak ve çok günlük bir enfeksiyon boyunca canlı, sağlam bir konakta konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesini kolaylaştırmak için alternatif bir model organizma olarak popülerlik kazanmıştır8,9. Zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık sistemi 24 saat döllenme sonrası (hpf)10kadar erken gelişir ve adaptif sistemin 11 geliştirmesi4-6hafta sürer , doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının izolasyonda değerlendirilebileceği bir zaman aralığı sağlar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkileri insanlar ve zebra balıkları arasında iyi korunmuş11. Zebra balıkları, optik netlik (sağlam konakçıların yüksek çözünürlüklü canlı görüntülenmesine izin verir) ve genetik çekiş (moleküler mekanistik çalışmaları kolaylaştıran) dahil olmak üzere bu yanıtların araştırılmasını kolaylaştıran birçok özelliğe sahiptir.
Burada açıklanan larva zebra balığı Aspergillus enfeksiyon modeli başlangıçta Knox ve ark.12. Son zamanlarda grubumuz ve diğerleri tarafından konak bağışıklık mekanizmaları12,13,konak-patojen etkileşimleri13 , 14,15, immünosupresyon mekanizmaları 13,16,17,mantar virülansı18ve mantar önleyici ilaç etkinliği19,20‘ yi araştırmak için genişletilmiştir. Bu model, insan aspergillosisinin birden fazla yönünü yeniden özetler. İmmün yetme larvalar dirençli olsa da, bağışıklık sistemi baskılanmış larvalar enfeksiyona yenik düşebilir12,13,16,17.
Bu modelde, fagositlerle daha az nüfuslu bir alan olan larvaların arka beyin ventriküllerine spor enjekte edilerek lokalize bir enfeksiyon kurulur ve fagosit işe alımı ve davranışıdeğerlendirilebilir 12,13. Makrofajların, insanlarda Aspergillus sporlarına karşı ilk savunma hattı olarak hareket ettiğine inanılmaktadır 1 vememeli modelleri6,21. Benzer şekilde, zebra balığı modelinde, enjekte edilen Aspergillus sporlarına makrofajlar işe toplanırken, nötrofiller hipnoz büyümesine yanıt olarak ikinci olarak işe alınmaktadır12,13,22. Bu modelden, Aspergillus’un 7 günden fazla enfeksiyondan sonra wildtype immün yetmsiz larvalarda devam edebileceği de öğrenilmiştir. Ayrıca, enfeksiyonun tüm seyri aynı canlı hayvanlarda günlük konfokal görüntüleme ile takip edilebilir.
Bu protokol, döllenme sonrası 2 günlük (2 dpf) larvaların arka beyin ventriküllerine spor enjekte etmek için mikroenjeksiyon tekniğini açıklar. Zebra balığı larvaları beslenmeden 10 dpf’ye kadar yaşayabildiği için enfeksiyon 7 güne kadar izlenir. İmmünsüpresyon ilaç tedavisi ile indüklenebilir ve ilaçların larvalara uygulanması da tarif edilir. Son olarak, bireysel larvalardan CFO’ların ölçülmesi ve günlük canlı görüntüleme kurulumu da dahil olmak üzere enfeksiyon ilerlemesini takip etmek için iki yöntem açıklanmaktadır.
Burada açıklanan enfeksiyon modeli konak immün yanıtları, konak-patojen etkileşimleri ve mantar patogenezini analiz etmek için faydalıdır12,13,14,15. Bu bilgiler, floresan etiketli patojenlerin ve konak hücrelerin13, larva sağkalımının ve zaman içinde CFU kalıcılığının yüksek çözünürlüklü görüntülemesinden elde edilebilir.
Mikroenjeksiyon tekniği bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir ve farklı mikroenjeksiyon ekipmanları ve kurulumları kullanırken ayarlanması gerekebilir. Özellikle, enjeksiyon basıncı ve zamanı iki ana değişkendir ve iğne tarafından çıkarılan hacmin ~3 nL olduğundan emin olmak için ayarlanabilir. İğneninpsle kırpılarak belirlenen boyutu, enjekte edilen spor sayısını da düzenler; ancak, daha büyük bir açıklık larva doku hasarına neden olabilir. Öte yandan, bir açıklığın çok küçük kısmı nispeten büyük sporların (>2 μm) dışarı çıkmasına izin vermez ve iğne tıkanmasına neden olabilir. Bu durumda, iğne biraz daha büyük bir açıklığa sahip olacak şekilde kapatılabilir.
Bakterilerin mikroenjeksiyonu için diğer protokoller homojen bir enjeksiyon karışımının korunmasına yardımcı olmak için PVP-40’ı kullanır, ancak bu taşıyıcıyı Aspergillus sporlarıyla kullanmakta herhangi bir avantaj bulamadık. İğnenin tıkanması, iğneyi yüklemeden önce herhangi bir kümeyi kırmak için mantar preparatının iyice girdaplanmasıyla hafifletilebilir. Bazen, iğnedeki bir tıkanıklık, basıncı veya enjeksiyon süresini geçici olarak artırarak ve iğne larvaları çevreleyen sıvıdayken mikroinjektörü tetikleyerek de yerinden çıkabilir. Basınç ve enjeksiyon süresi daha sonra tekrar önceki seviyelere indirilmelidir. Diğer durumlarda, bir tıkanıklık çıkarılamaz ve yeni bir iğnenin yüklenmesi ve yeniden kalibre edilmesi gerekir.
Bu protokol larva başına ~30-70 spor enjekte etmek için tasarlanmıştır. Spor hazırlığının konsantrasyonuna ve enjekte edilen hacme dayanarak, bu sayının oldukça düşük olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, ampirik olarak bu koşullar altında enjekte edilen spor sayısının bu olduğu bulunmuştur. Bu farkın neden oluştuğu bilinmemektedir, ancak iğnedeki spor topaklarından kaynaklanabilir. Daha fazla sayıda spor enjekte etme girişimlerimiz büyük ölçüde başarısız oldu.
Yaklaşık 30-70 spor enjekte edildiğinden emin olmak ve tüm larvalar boyunca enjeksiyonların tutarlılığını korumak için, larvaları çevreleyen E3’e enjekte ederek spor sayısını kontrol edin. Tüm enjeksiyonlar boyunca her beş ila altı larvada bir tekrarlayın. Spor sayısı değişiyor gibi görünüyorsa, basınç ve/ veya enjeksiyon süresi birden fazla larvaya tutarlı sayıda spor enjekte etmek için ayarlanabilir. Bununla birlikte, enjeksiyon dozun öncelikle arka beyinde kalmasına ve orta beyin ve ön beyinleri doldurmamasına dikkat edilmelidir.
Lokalize bir enfeksiyon sağlamak için, spor süspansiyonu arka beyin ventrikül içinde yer almalıdır. Bu, enjeksiyondan hemen sonra fenol kırmızısı lekeleme ile görselleştirilebilir, ancak kırmızı renk zamanla yayılır. Enjeksiyonlar için, otik veziklin etrafındaki bölge, ventrikülü 45 ° – 65 ° açıyla delmek ve ulaşmak için kullanılır. Bu bölgenin ana kan damarları yoktur, daha az doku hasarına neden olur ve anında iyileşir. Ventrikül üzerindeki deri delinirse, spor süspansiyonu dışarı sızabilir, çünkü Aspergillus spor enjeksiyonları için kullanılması gereken iğne bakteriyel süspansiyonlar için kullanılandan daha büyüktür. Başarısız bir şekilde enjekte edilen veya yanlışlıkla hasar gören larvalar, kırmızı bir işaret oluşturmak için yumurta sarısına birkaç kez enjekte edilerek veya larvayı iğneyle sıranın dışına sürükleyerek işaretlenebilir. Bir dizi enjeksiyon tamamlandıktan sonra, geri kalanı plakadan yıkanmadan önce bu larvalar çıkarılmalı ve atılmalıdır. Metilen mavisi olmayan E3, enjeksiyondan önce larvaları uyuşturmak ve ayrıca enjeksiyonlardan sonra larvaları tutmak için kullanılır, çünkü metilen mavisi mantar karşıtıdır.
Enjeksiyon anında, CFU sayıları enfekte konakçı içindeki uygulanabilir sporların sayısını temsil eder. Bununla birlikte, sporlar hyphae’ye çimlenirse, bunlar homojenizasyon sırasında ayrı uygulanabilir “mantar birimlerine” ayrılabilir ve birden fazla koloniye yol açabilir. Ya da kırılmamış çok hücreli bir hypha tek bir koloniye yol açabilir, bu da mantar yükünün ortalama, ancak kesin olmayan bir temsili ile sonuçlanır. Bu, CFU sayılarının, enjekte edilen sporların kaderinin görsel verilerini sağlayan bireysel larvaların boyuna mikroskopisi ile birleştirilmesiyle azaltılabilir.
Memeli sistemi ile karşılaştırıldığında, zebra balığı larva enfeksiyon modeli optik erişilebilirliği nedeniyle özellikle önemlidir. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin işe alınması ve yanıtları canlı sağlam bir konakçı içinde görselleştirilebilir. Bu, her hedefin canlı bir hayvanda Aspergillus sporlarına karşı makrofaj veya nötrofil reaksiyonunu nasıl etkilediğini analiz etmek için moleküler hedeflerin genetik veya kimyasal inhibisyonu ile birlenebilir.
Zebrabalığı larvası Aspergillus enfeksiyon modeli IA 12 , 13 ,14, 15,16,17,18,19,20,22‘ninfarklı yönlerini tanımlamada etkili olmaya devam ederken, başka genişleme alanları da vardır. Konakçı tarafından, hücresel düzeyde bağışıklık tepkilerini tanımlamak için kullanılır, ancak bu, hedeflenen morfoino, CRISPR, kararlı mutant çizgileri veya kimyasal maruziyet ile birleştirerek bağışıklık mekanizmalarını moleküler düzeyde analiz etmek için genişletilebilir. Bir uyarı, zebra balıklarında bilinen tüm memeli doğuştan gelen bağışıklık yolu bileşenleri için homologların tanımlanmış olmamasıdır.
Patojen tarafından, farklı türlerin ve suşların virülansı tanımlanmıştır. Gelecekteki araştırmaların umut verici bir yolu, belirli genlerin veya proteinlerin virülans faktörleri olarak nasıl katkıda bulunduğunu test etmek için mutant Aspergillus suşlarının kullanılmasıdır. Böylece, bu proteinleri hedeflemek için yeni mantar önleyici ilaçlar geliştirilebilir. Mevcut mantar önleyici ilaçlar insan hastalarda düşük etkililiğe sahiptir ve mantarlarda bu ilaçlara karşı artan direnç vardır28. Bu in vivo model, bu ilaçların neden başarısız olduğunu araştırmak ve yeni anti-mantar ilaçlarının etkinliğini test etmek için bir ara model olarak kullanılabilir. Genel olarak, bu model kullanılarak keşfedilen bulgular, Aspergillusenfekte hastalar için gelecekteki etkili tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü tarafından K22AI134677 Ödül Numarası altında desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |