このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫における アスペルギルス 感染モデルについて説明する。 アスペルギルス 胞子は幼虫の後脳に微量に注入され、免疫抑制を誘導するために化学的処理が使用されます。感染進行は、毎日のイメージング設定を介して、真菌の成長および免疫応答、ならびにコロニー形成単位めっきによる生きた胞子の列挙を監視する。
侵襲性アスペルギルス症(IA)は、免疫不全の個人の間で最も一般的な真菌感染症の1つです。抗真菌薬が利用できるにもかかわらず、IAは感染した免疫不全患者において>50%の死亡率を引き起こす可能性がある。新しい治療法を開発するためには、感染感受性と感染患者の低生存率に寄与する宿主および病原体因子の両方を決定することが重要です。生来の免疫応答は 、アスペルギルス 胞子の認識とクリアランスにおいて極めて重要な役割を果たしますが、正確な細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていません。信頼できるモデルは宿主と病原体の間の詳細な機械相互作用を調査するために必要である。ゼブラフィッシュの幼虫の光学的明瞭さと遺伝的な難解さは、生きている無傷の宿主における複数のヒト細菌および真菌感染症の宿主病原体相互作用を研究する興味深いモデルとなる。このプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュ アスペルギルス 感染モデルを記述する。まず、 アスペルギルス 胞子を単離し、マイクロインジェクションを介してゼブラフィッシュ後脳心室に注入する。次いで、免疫抑制薬などの化学阻害剤を幼虫水に直接添加する。注射された幼虫における感染を監視する2つの方法が記載されており、コロニー形成ユニット(CFU)列挙体および2)繰り返し、毎日のライブイメージングセットアップのための幼虫の均質化を含む。全体的に、これらの技術は、生体内で のアスペルギルス 感染の進行を機械論的に分析するために使用することができ、宿主と病原体の相互作用を尋問するために異なる宿主の背景および アスペルギルス 株に適用することができる。
アスペルギルス・フミガトゥスは、ユビキタスな窒息菌であり、その空中胞子は屋内と屋外の両方で見つけることができます1.これらの胞子は、すべての人によって吸入されるが、免疫能力の個人1、2の肺から効果的にクリアされる。しかし、嚢胞性線維症などの肺の状態が変化した人は、肺の真菌発芽のために気管支肺アスペルギルス症を発症する可能性がある3。この感染の最も重篤な形態は、侵襲性アスペルギルス症(IA)、免疫不全の個体に影響を及ぼし、真菌を他の器官2,3に増殖することを伴う。IAは、抗真菌療法の利用可能性にもかかわらず、感染した患者の>50%の死亡につながる4.免疫能力のある個人では、自然免疫応答は吸入胞子1をクリアする上で大きな役割を果たす。しかし、この自然免疫クリアランスに寄与する特定のメカニズムは十分に理解されていない。IAの新しい治療法を見つけるためには、アスペルギルスのクリアランスにおける主要な自然免疫細胞(マクロファージおよび好中球)の細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。
哺乳類モデルは真菌性毒性因子および宿主免疫応答の同定に役立っていますが、細胞レベルでの宿主と病原体の相互作用には視覚アクセシビリティが制限されています。組織培養実験では、動物全体に存在する複雑な多細胞環境と相互作用を完全に再現することはできません。したがって、ゼブラフィッシュは、このギャップを埋め、複数日感染8、9を越えて生きている無傷の宿主における宿主間相互作用の研究を容易にする代替モデル生物として人気を集めている。ゼブラフィッシュの自然免疫系は早くも24時間の受精後(hpf)10で発達し、適応体系は11を発症するのに4〜6週間かかり、自然免疫応答を単独で評価できる時間枠を提供する。自然免疫応答は、ヒトとゼブラフィッシュ11の間で十分に保存されている。ゼブラフィッシュは、光学的明瞭さ(無傷の宿主の高解像度のライブイメージングを可能にする)や遺伝的な難易度(分子機械学的研究を容易にする)など、これらの応答の調査を促進する多くの資質を有する。
ここで説明した幼虫ゼブラフィッシュアスペルギルス感染モデルは、もともとKnoxららによって開発されました。最近、我々のグループおよび他の人々によって、宿主免疫機構12、13、宿主病原体相互作用、免疫抑制13、16、17、真菌性毒性18、および抗真菌薬有効性19、20のメカニズムを調査するために拡大されている。このモデルは、ヒトアスペルギルス症の複数の側面を再現します。免疫担当の幼虫は耐性であるが、免疫不全の幼虫は感染に屈することができる12,13,16,17.
このモデルでは、幼虫の後脳心室に胞子を注入することにより局所感染が確立され、食細胞が少ない領域、および食細胞の採用と行動を評価することができる12、13。マクロファージは、ヒト1および哺乳類モデル6,21におけるアスペルギルス胞子に対する第一線の防御線として作用すると考えられている。同様に、ゼブラフィッシュモデルでは、マクロファージは、注入されたアスペルギルス胞子にリクルートされ、一方で好中球は、催眠成長12、13、22に応答して二次的に募集される。このモデルから、アスペルギルスは、感染の7日以上後に野生型免疫能力幼虫に持続できることも知られた。さらに、感染の全経過は、毎日の共焦点イメージングによって同じ生きた動物に続くことができる。
このプロトコルは、受精後2日間の後脳心室に胞子を注入する微小注入の技術を記述する(2dpf)幼虫。ゼブラフィッシュの幼虫は餌を与えずに最大10dpfまで生きることができるので、感染は最大7日間監視されます。免疫抑制は薬物治療によって誘発され得るが、幼虫への薬物の適用も記載されている。最後に、個々の幼虫からのCFUsの定量化および毎日のライブイメージング設定を含む、感染進行に従う2つの方法が記載される。
ここで説明する感染モデルは、宿主の免疫応答、宿主病原体相互作用、および真菌病原体12、13、14、15を分析するために有益である。この情報は、蛍光標識病原体および宿主細胞13の高解像画像化、幼虫生存、およびCFU持続性を経て得ることができる。
マイクロインジェクション技術は、このプロトコルの成功に不可欠であり、異なるマイクロインジェクション装置およびセットアップを使用する場合に調整する必要があります。特に、射出の圧力と時間は2つの主要な変数であり、針によって排出される容積が〜3nLであることを確認するために調節することができる。鉗子でそれを切り取ることによって決定される針のサイズはまた注入される胞子の数を調節する;しかし、大きな開口部は、幼虫に組織損傷を引き起こす可能性があります。一方、開口部が小さすぎると、比較的大きな胞子(>2 μm)が外に出て、針詰まりを引き起こす可能性があります。この場合、針は、わずかに大きな開口部を持つようにクリップすることができます。
細菌のマイクロインジェクションのための他のプロトコルは、均質な注入混合物を維持するためにPVP-40を利用するが、我々は アスペルギルス 胞子とこのキャリアを使用する上で任意の利点を発見していない。針の詰まりは、真菌製剤を徹底的にボルテックスして、針をロードする前に塊を壊すことによって軽減することができます。時には、針の詰まりは、一時的に圧力または注射時間を増加させ、針が幼虫を取り巻く液体中にある間にマイクロインジェクターを引き起こすことによって取り除かれる。圧力と射出時間は、前のレベルに再び減少する必要があります。他のケースでは、詰まりを除去することができず、新しい針をロードし、再調整する必要があります。
このプロトコルは、幼虫あたり〜30~70個の胞子を注入するように設計されています。胞毛調製物の濃度と注入される体積に基づいて、この数はかなり低いことが知られている。しかし、これはこれらの条件下で注入された胞子の数であることを経験的に発見されています。なぜこの違いが起こったのかは不明ですが、針の胞毛が凝集している可能性があります。より多くの胞子を注入しようとする私たち自身の試みは、ほとんど失敗しています。
約30~70個の胞子が注入され、すべての幼虫を通して注射の一貫性を維持するために、幼虫を取り巻くE3に注入して胞子の数を確認してください。すべての注射を通して5〜6匹の幼虫ごとにこれを繰り返します。胞子数が変化すると思われる場合は、圧力および/または注入時間を調整して、複数の幼虫に一貫した数の胞子を注入することができます。しかし, 注意してください注射用量は、主に後脳に残り、中脳と前脳を埋めないことを.
局所感染を確実にするために、胞毛懸濁液は後脳心室内に含まれるべきです。これは、注射直後のフェノールレッド染色によって視覚化することができますが、赤い色は時間とともに拡散します。注射の場合、オティックベシクルの周りの領域を貫通し、45°~65°の角度で心室に到達します。この領域は、主要な血管を持っていない、より少ない組織の損傷を引き起こし、瞬時に治癒します。心室の皮膚が突き刺さると、 アスペルギルス 胞子注射に使用しなければならない針が細菌懸濁液よりも大きいため、胞子懸濁液が漏出する可能性があります。誤って注射または誤って損傷した幼虫は、黄身に数回注入して赤いマークを作成するか、または針で列から幼虫をドラッグすることによってマークすることができます。一連の注射が完了した後、これらの幼虫は、残りの部分がプレートから洗い流される前に除去され、処分されるべきである。メチレンブルーのないE3は、注射前に幼虫を麻酔し、注射後も幼虫を保つために使用されます。
注射時に、CFUカウントは感染した宿主内の生存可能な胞子の数を表す。しかし、胞子が催眠術に発芽する場合、これらは均質化中に別々の生存可能な「真菌単位」に分かれて、複数のコロニーを生じさせることができる。または、切れ目のない多細胞性催眠術は、単一のコロニーを生じさせ、真菌の負担の平均値を示すが不正確である。これは、CFUカウントと個々の幼虫の縦方向顕微鏡を組み合わせることで緩和することができ、注入された胞子の運命の視覚的データを提供する。
哺乳類系と比較して、ゼブラフィッシュ幼虫感染モデルは、その光学的なアクセシビリティのために特に重要である。自然免疫細胞の徴生と応答は、生きた無傷の宿主の中で視覚化することができる。これは、分子標的の遺伝的または化学的阻害と組み込まれ、各標的が生きている動物の アスペルギルス 胞子に対するマクロファージまたは好中球反応にどのように影響するかを分析することができる。
ゼブラフィッシュ幼虫アスペルギルス感染モデルは、IA12、13、14、15、16、17、18、19、20、22の異なる側面を記述するのに役立ち続けていますが、他の拡大領域があります。宿主側からは、細胞レベルの免疫応答を記述するために使用されますが、標的モルフォリーノ、CRISPR、安定した突然変異線、または化学的暴露と組み合わせることによって、分子レベルで免疫メカニズムを分析するために拡張することができます。1つの注意点は、すべての既知の哺乳類の自然免疫経路成分のホモログはゼブラフィッシュで同定されていないということです。
病原体側からは、異なる種および株の病原性が記載されている。将来の研究の有望な道は、特定の遺伝子またはタンパク質が毒性因子としてどのように寄与するかをテストするために変異ア スペルギルス 株を使用することです。それにより、新規抗真菌薬を開発して、これらのタンパク質を標的とすることができる。現在の抗真菌薬は、ヒト患者の有効性が低く、真菌28でこれらの薬剤に対する耐性が高まっている。このin vivoモデルは、これらの薬物が失敗した理由を調査するために使用することができ、新しい抗真菌薬の有効性をテストするための中間モデルとして使用することができます。全体として、このモデルを用いて発見された知見は、 アスペルギルス感染患者に対する効果的な治療法の将来の開発を促進することができる。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立衛生研究所の国立アレルギー・感染症研究所が受賞番号K22AI134677の下で支援しました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |