פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס בזחלים זברה. נבגי אספרגילוס הם microinjected לתוך hindbrain של זחלים, טיפול כימי משמש כדי לגרום לדיכוי המערכת החיסונית. התקדמות הזיהום מנוטרת באמצעות מערך הדמיה יומי כדי לפקח על צמיחה פטרייתית ותגובות חיסוניות, כמו גם ספירה של נבגים חיים על ידי ציפוי יחידה יוצר מושבה.
אספרגילוזיס פולשני (IA) הוא אחד הזיהומים הפטרייתיים הנפוצים ביותר בקרב אנשים immunocompromised. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, IA יכול לגרום >50% תמותה בחולים immunocompromised נגועים. זה חיוני כדי לקבוע הן גורמים מארחים ופתוגן התורמים רגישות לזיהום ושיעורי הישרדות נמוכים בחולים נגועים על מנת לפתח טיפולים חדשניים. תגובות חיסוניות מולדות ממלאות תפקיד מרכזי בהכרה וסיווג של נבגי אספרגילוס, אם כי מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים והמולקולריים המדויקים. מודלים אמינים נדרשים כדי לחקור אינטראקציות מכניות מפורטות בין המארח לפתוגן. הבהירות האופטית והמתיחה הגנטית של זחלי הזברה הופכים אותם למודל מסקרן לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן של זיהומים חיידקיים ופטריות אנושיים מרובים במארח חי ושלם. פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה. ראשית, נבגי אספרגילוס מבודדים ומוזרקים לתוך החדר האחורי של דג הזברה דרך מיקרו-אינג’ינג. לאחר מכן, מעכבים כימיים כגון תרופות לדיכוי המערכת החיסונית מתווספים ישירות למים הזחל. שתי שיטות כדי לפקח על הזיהום בזחלים מוזרקים מתוארים, כולל 1) הומוגניזציה של זחלים עבור המושבה להרכיב יחידה (CFU) ספירה ו 2) חוזר ונשנה, מערך הדמיה חיה יומית. בסך הכל, טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח באופן מכני את ההתקדמות של זיהום אספרגילוס vivo והוא יכול להיות מיושם על רקע מארח שונים זנים אספרגילוס לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן.
Aspergillus fumigatus היא פטרייה סאפרופיטית בכל מקום, ואת הנבגים המוטסים שלה ניתן למצוא הן בפנים והן בחוץ1. נבגים אלה הם בשאיפה על ידי כולם אבל להיות פינה ביעילות מן הריאות של אנשים immunocompetent1,2. עם זאת, אנשים עם תנאי ריאות השתנו כגון סיסטיק פיברוזיס יכול לפתח אספרגילוזיס bronchopulmonary עקב נביטה פטרייתית בריאות3. הצורה החמורה ביותר של זיהום זה, אספרגילוזיס פולשני (IA), משפיע על אנשים immunocompromised וכרוך בצמיחה של הפטרייה לאיברים אחרים2,3. IA מוביל >50% מוות של חולים נגועים למרות הזמינות של טיפולים אנטי פטרייתיים4. אצל אנשים immunocompetent, תגובות חיסוניות מולדות לשחק תפקיד מרכזי בפינוי נבגים בשאיפה1. עם זאת, המנגנונים הספציפיים התורמים לסיווג חיסוני מולד זה אינם מובנים היטב. חשוב להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים של תאי חיסון מולדים מרכזיים (כלומר, מקרופאגים ונויטרופילים) באישור אספרגילוס על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור IA.
בעוד מודלים יונקים סייעו בזיהוי גורמי ארסיות פטרייתיים ומארחים תגובותחיסוניות 5,6, נגישות חזותית מוגבלת לאינטראקציות מארח-פתוגן ברמה התאית. ניסויים בתרבית רקמות אינם יכולים לשחזר באופן מלא את הסביבה הרב-תאית המורכבת ואת האינטראקציות הקיימות בבעלי חיים שלמים7. לכן, זברהפיש צברה פופולריות כאורגניזם מודל חלופי כדי למלא את הפער הזה ולאפשר את המחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן במארח חי, שלם על פני זיהום רב-יומי8,9. מערכת החיסון המולדת זברה מתפתחת כבר 24 שעות לאחר ההפריה (hpf)10, ואת המערכת האדפטיבית לוקח 4-6 שבועות לפתח11, מתן חלון זמן שבו תגובות חיסוניות מולדות ניתן להעריך בבידוד. תגובות חיסוניות מולדות שמורות היטב בין בני אדם לבין זברה דג11. זברהפיש יש תכונות רבות המאפשרות את החקירה של תגובות אלה, כולל בהירות אופטית (המאפשר הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של מארחים שלמים) ואת המתיחה הגנטית (אשר מקל על מחקרים מכניים מולקולריים).
מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה המתואר כאן פותח במקור על ידי נוקס ואח’12. זה הורחב לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו ואחרים לחקור מנגנונים חיסוניים מארחים12,13, המארח-פתוגן אינטראקציות13,14,15, מנגנונים של דיכוי המערכת החיסונית13,16,17, ארסיות פטרייתית18, ויעילות תרופה אנטי פטרייתית19,20. מודל זה מסכם היבטים מרובים של אספרגילוזיס אנושי. בעוד זחלים immunocompetent עמידים, זחלים immunocompromised יכול להיכנע לזיהום12,13,16,17.
במודל זה, זיהום מקומי נקבע על ידי הזרקת נבגים לתוך החדר hindbrain של זחל, אזור מאוכלס פחות עם phagocytes, גיוס phagocyte והתנהגות ניתן להעריך12,13. הוא האמין כי מקרופאגים לשמש קו ההגנה הראשון נגד נבגי אספרגילוס בבני אדם1 ומודלים יונקים6,21. באופן דומה, במודל הזברה, מקרופאגים מגויסים לנבגי אספרגילוס מוזרקים, בעוד נויטרופילים מגויסים באופן שני בתגובה לצמיחה מהפכלית12,13,22. ממודל זה, נודע גם כי אספרגילוס יכול להתמיד זחלים immunocompetent wildtype לאחר יותר מ 7 ימים של זיהום. יתר על כן, את כל מהלך הזיהום ניתן לעקוב באותם בעלי חיים חיים על ידי הדמיה קונפוקלית יומית.
פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של microinjection להזריק נבגים לתוך החדר hindbrain של 2 ימים לאחר ההפריה (2 dpf) זחלים. הזיהום מנוטר לאחר מכן עד 7 ימים, כמו זחלים זברה יכול לחיות עד 10 dpf ללא האכלה. דיכוי המערכת החיסונית יכול להיגרם על ידי טיפול תרופתי, ואת היישום של תרופות לזחלים מתואר גם. לבסוף, מתוארות שתי שיטות למעקב אחר התקדמות הזיהום, כולל כימות של CFUs מזחלים בודדים והתקנת הדמיה חיה יומית.
מודל הזיהום המתואר כאן מועיל לניתוח התגובות החיסוניות המארחות, אינטראקציות מארח-פתוגן ופתוגנזהפטרייתית 12,13,14,15. מידע זה יכול להיגזר מהדמיה ברזולוציה גבוהה של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית ותאים מארחים13, הישרדות זחל והתמדה של CFU לאורך זמן.
טכניקת microinjection היא קריטית להצלחת פרוטוקול זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים בעת שימוש בציוד microinjection שונים והגדרות. בפרט, הלחץ וזמן ההזרקה הם שני משתנים עיקריים וניתן להתאים אותם כדי להבטיח כי נפח נפלט על ידי המחט הוא ~ 3 nL. גודל המחט כפי שנקבע על ידי גזירתו עם מלקחיים גם מסדיר את מספר הנבגים מוזרקים; אמנם, פתח גדול יותר יכול לגרום נזק לרקמות הזחל. מצד שני, קטן מדי של פתח לא יאפשר את הנבגים גדולים יחסית (>2 מיקרומטר) החוצה יכול להוביל סתימת מחט. אם זה קורה, המחט ניתן reclipped יש פתח קצת יותר גדול.
פרוטוקולים אחרים עבור microinjection של חיידקים לנצל PVP-40 כדי לסייע בשמירה על תערובת הזרקה הומוגנית, אבל לא מצאנו שום יתרון בשימוש במנשא זה עם נבגי אספרגילוס. סתימת המחט יכולה להיות מופחתת על ידי מערבולת ההכנה הפטרייתית ביסודיות כדי לשבור את כל גושים לפני טעינת המחט. לפעמים, סתימת המחט יכול גם להיות נעקר על ידי הגדלה זמנית של זמן הלחץ או ההזרקה והפעלת microinjector בעוד המחט היא בנוזל המקיף את הזחלים. הלחץ וזמן ההזרקה לאחר מכן צריך להיות ירד שוב לרמות קודמות. במקרים אחרים, לא ניתן להסיר סתימה, ומחט חדשה צריכה להיות טעונה וכיול מחדש.
פרוטוקול זה נועד להזריק ~ 30-70 נבגים לכל זחל. זה ידוע כי בהתבסס על הריכוז של הכנת הנבג ואת נפח מוזרק, מספר זה הוא נמוך למדי. עם זאת, נמצא באופן אמפירי כי זהו מספר הנבגים מוזרקים בתנאים אלה. מדוע הבדל זה מתרחש אינו ידוע, אבל זה יכול להיות בגלל נבג גושים במחט. הניסיונות שלנו להזריק מספר גדול יותר של נבגים לא צלחו ברובם.
כדי להבטיח כ 30-70 נבגים מוזרקים ולשמור על עקביות של זריקות בכל הזחלים, לבדוק את מספר הנבגים על ידי הזרקת על E3 המקיף את הזחלים. חזור על זה כל חמישה עד שישה זחלים לאורך כל הזריקות. אם ספירת הנבגים משתנה, ניתן להתאים את הלחץ ו/או זמן ההזרקה כדי להזריק מספר עקבי של נבגים על פני זחלים מרובים. עם זאת, יש להקפיד כי מינון ההזרקה נשאר בעיקר ב hindbrain ואינו ממלא את midbrain ו forebrain.
כדי להבטיח זיהום מקומי, ההשעיה נבג צריך להיות כלול בתוך החדר hindbrain. זה יכול להיות דמיינו על ידי כתמים אדומים פנול רק לאחר ההזרקה, אם כי הצבע האדום מתפזר עם הזמן. עבור זריקות, האזור סביב vesicle אוטי משמש לנקב דרך ולהגיע לחדר בזווית של 45°-65°. באזור זה אין כלי דם עיקריים, גורם פחות נזק לרקמות, ומרפא באופן מיידי. אם העור מעל החדר הוא פירסינג, ההשעיה נבג ניתן לדלוף החוצה, כי המחט שיש להשתמש בהם עבור זריקות נבג אספרגילוס הוא גדול יותר מזה משמש השעיות חיידקים. זחלים מוזרקים או פגומים בטעות יכולים להיות מסומנים על ידי הזרקת חלמון כמה פעמים כדי ליצור סימן אדום או על ידי גרירת הזחל מחוץ לשורה עם המחט. לאחר קבוצה של זריקות הושלמה, זחלים אלה יש להסיר ולהיפטר לפני השאר נשטפים מהצלחת. E3 ללא כחול מתילן משמש כדי להרדים זחלים לפני ההזרקה וגם לשמור זחלים לאחר הזריקות, כי כחול מתילן הוא אנטי פטרייתי.
בזמן ההזרקה, ספירות CFU מייצגות את מספר הנבגים הקיימים בתוך המארח הנגוע. עם זאת, אם הנבגים לנבוט לתוך hyphae, אלה יכולים להיות מחולקים נפרד קיימא “יחידות פטרייתיות” במהלך הומוגניזציה יכול להוליד מושבות מרובות. לחלופין, היפה רב-תאית רצופה יכולה להוליד מושבה אחת, וכתוצאה מכך ייצוג ממוצע, אך לא סביר, של הנטל הפטריוני. זה יכול להיות מקל על ידי שילוב ספירת CFU עם מיקרוסקופיה אורך של זחלים בודדים, אשר מספק נתונים חזותיים של גורלם של נבגים מוזרקים.
בהשוואה למערכת היונקים, מודל זיהום זחל הזברה משמעותי במיוחד בשל הנגישות האופטית שלו. הגיוס והתגובה של תאי חיסון מולדים ניתן לדמיין בתוך מארח שלם חי. זה יכול להיות משולב עם עיכוב גנטי או כימי של מטרות מולקולריות כדי לנתח כיצד כל מטרה משפיעה על תגובת מקרופאג ‘ או נויטרופילים נגד נבגי אספרגילוס בבעל חיים.
בעוד זחל זברה אספרגילוס מודל ההדבקה ממשיך להיות אינסטרומנטלי בתיאור היבטים שונים של IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, ישנם תחומים אחרים של התרחבות. מהצד המארח, הוא משמש לתיאור תגובות חיסוניות ברמה התאית, אך ניתן להרחיב זאת כדי לנתח מנגנונים חיסוניים ברמה המולקולרית על ידי שילובו עם מורפולינו ממוקד, CRISPR, קווי מוטנטים יציבים או חשיפה כימית. אזהרה אחת היא כי homologues עבור כל רכיבי מסלול חיסוני מולד יונקים ידועים לא זוהו זברה.
מצד הפתוגן תוארה ארסיות של מינים וזנים שונים. שדרה מבטיחה של מחקר עתידי היא השימוש בזני אספרגילוס מוטנטים כדי לבדוק כיצד גנים או חלבונים ספציפיים תורמים כגורמי ארסיות. ובכך, תרופות אנטי פטרייתיות חדשניות ניתן לפתח כדי למקד חלבונים אלה. תרופות אנטי פטרייתיות הנוכחי יש יעילות נמוכה בחולים אנושיים ויש עמידות גוברת לתרופות אלה פטריות28. מודל זה vivo יכול לשמש כדי לחקור מדוע תרופות אלה להיכשל כמודל ביניים כדי לבדוק את היעילות של תרופות אנטי פטרייתיות הרומן. בסך הכל, הממצאים שהתגלו באמצעות מודל זה יכולים להקל על פיתוח עתידי של טיפולים יעילים לחולים נגועים באספרגילוס.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K22AI134677. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |