Dieses Protokoll beschreibt ein Aspergillus-Infektionsmodell bei Zebrafischlarven. Aspergillus Sporen werden mikroinjiziert in das Hinterhirn von Larven, und chemische Behandlung wird verwendet, um Immunsuppression zu induzieren. Das Fortschreiten der Infektion wird über eine tägliche Bildgebung überwacht, um das Pilzwachstum und die Immunantworten sowie die Aufzählung lebender Sporen durch Koloniebildbildung zu überwachen.
Invasive Aspergillose (IA) ist eine der häufigsten Pilzinfektionen bei immungeschwächten Personen. Trotz der Verfügbarkeit von Antimykotika kann Feine >50% Mortalität bei infizierten immungeschwächten Patienten verursachen. Es ist entscheidend, sowohl Wirts- als auch Krankheitserregerfaktoren zu bestimmen, die zur Anfälligkeit für Infektionen und niedrigen Überlebensraten bei infizierten Patienten beitragen, um neuartige Therapeutika zu entwickeln. Angeborene Immunantworten spielen eine zentrale Rolle bei der Erkennung und Clearance von Aspergillus Sporen, obwohl wenig über die genauen zellulären und molekularen Mechanismen bekannt ist. Zuverlässige Modelle sind erforderlich, um detaillierte mechanistische Wechselwirkungen zwischen wirt und Pathogen zu untersuchen. Die optische Klarheit und genetische Traktionsfähigkeit von Zebrafischlarven machen sie zu einem faszinierenden Modell, um Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen mehrerer menschlicher Bakterieller und Pilzinfektionen in einem lebenden und intakten Wirt zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Larvenzebrafisch Aspergillus Infektionmodell. Erstens werden Aspergillus-Sporen isoliert und mittels Mikroinjektion in den Zebrafisch-Hinterhirn-Ventrikel injiziert. Dann werden chemische Inhibitoren wie immunsuppressive Medikamente direkt in das Larvenwasser aufgenommen. Es werden zwei Methoden zur Überwachung der Infektion bei injizierten Larven beschrieben, darunter die 1) Homogenisierung von Larven zur Aufzählung der Koloniebildenden Einheit (CFU) und 2) eine wiederholte, tägliche Live-Bildgebung. Insgesamt können diese Techniken verwendet werden, um das Fortschreiten der Aspergillus-Infektion in vivo mechanistisch zu analysieren und können auf verschiedene Wirtshintergründe und Aspergillus-Stämme angewendet werden, um Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu behören.
Aspergillus fumigatus ist ein allgegenwärtiger sapraphytischer Pilz, und seine luftgetragenen Sporen können sowohl drinnen als auch draußen gefunden werden1. Diese Sporen werden von allen eingeatmet, aber effektiv aus der Lunge von immunkompetenten Individuen1,2gelöscht. Jedoch, Menschen mit veränderten Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose kann bronchopulmonale Aspergillose aufgrund von Pilzkeimung in der Lunge entwickeln3. Die schwerste Form dieser Infektion, invasive Aspergillose (IA), betrifft immungeschwächte Individuen und beinhaltet das Wachstum des Pilzes in andere Organe2,3. IA führt zu >50% Tod von infizierten Patienten trotz der Verfügbarkeit von Anti-Pilz-Therapien4. Bei immunkompetenten Individuen spielen angeborene Immunantworten eine wichtige Rolle bei der Beseitigung der eingeatmeten Sporen1. Die spezifischen Mechanismen, die zu dieser angeborenen Immunclearance beitragen, sind jedoch nicht gut verstanden. Es ist wichtig, die zellulären und molekularen Mechanismen der wichtigsten angeborenen Immunzellen (d. h. Makrophagen und Neutrophilen) in der Clearance von Aspergillus zu verstehen, um neue therapeutische Strategien für IA zu finden.
Während Säugetiermodelle bei der Identifizierung von Pilzvirulenzfaktoren und Wirtsimmunreaktionen5,6von entscheidender Bedeutung waren, ist die visuelle Zugänglichkeit für Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene begrenzt. Gewebekulturexperimente können die komplexe multizelluläre Umgebung und die Wechselwirkungen, die bei ganzen Tieren existieren, nicht vollständig rekapitulieren7. Daher hat Zebrafisch popularität als alternativer Modellorganismus gewonnen, um diese Lücke zu füllen und die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen in einem lebenden, intakten Wirt über eine mehrtägige Infektion zu erleichtern8,9. Der angeborene Zebrafisch entwickelt sich bereits 24 h nach der Befruchtung (hpf)10, und das adaptive System benötigt 4–6 Wochen, um11zu entwickeln, was ein Zeitfenster bietet, in dem angeborene Immunantworten isoliert beurteilt werden können. Angeborene Immunantworten sind gut zwischen Menschen und Zebrafischen11konserviert. Zebrafische haben viele Eigenschaften, die die Untersuchung dieser Reaktionen erleichtern, einschließlich optischer Klarheit (die eine hochauflösende Live-Bildgebung intakter Wirte ermöglicht) und genetische Traktionsfähigkeit (was molekulare mechanistische Studien erleichtert).
Das hier beschriebene Larvenzebrafisch-Infektionsmodell Aspergillus wurde ursprünglich von Knox et al.12entwickelt. Es wurde vor kurzem von unserer Gruppe und anderen erweitert, um Wirtsimmunmechanismen12,13, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen13,14,15, Mechanismen der Immunsuppression13,16,17, Pilzvirulenz18, und Anti-Pilz-Medikament Wirksamkeit19,20. Dieses Modell rekapituliert mehrere Aspekte der menschlichen Aspergillose. Während immunkompetente Larven resistent sind, können immungeschwächte Larven einer Infektion erliegen12,13,16,17.
In diesem Modell wird eine lokalisierte Infektion durch Injektion von Sporen in die Hinterhirn-Herzkammer von Larven, einem Gebiet weniger mit Phagozyten bevölkert, und Phagozyten Rekrutierung und Verhalten kann ausgewertet werden12,13. Es wird angenommen, dass Makrophagen als erste Verteidigungslinie gegen Aspergillus Sporen beim Menschen1 und Säugetiermodelle6,21. In ähnlicher Weise werden im Zebrafischmodell Makrophagen zu den injizierten Aspergillussporen rekrutiert, während Neutrophile sekundär als Reaktion auf das Hyphalwachstum rekrutiert werden12,13,22. Aus diesem Modell ist auch gelernt worden, dass Aspergillus nach mehr als 7 Tagen Infektion in immunkompetenten Wildtyplarven bestehen kann. Darüber hinaus kann der gesamte Verlauf der Infektion bei den gleichen lebenden Tieren durch tägliche konfokale Bildgebung verfolgt werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Technik der Mikroinjektion, um Sporen in die Hinterhirnkammer von 2 Tagen nach der Befruchtung (2 dpf) Larven zu injizieren. Die Infektion wird dann für bis zu 7 Tage überwacht, da Zebrafischlarven bis zu 10 dpf ohne Fütterung leben können. Immunsuppression kann durch medikamentöse Behandlung induziert werden, und die Anwendung von Medikamenten auf die Larven wird auch beschrieben. Schließlich werden zwei Methoden beschrieben, um die Infektionsprogression zu verfolgen, einschließlich der Quantifizierung von KBE aus einzelnen Larven und einer täglichen Live-Bildgebung.
Das hier beschriebene Infektionsmodell ist vorteilhaft für die Analyse der Wirtsimmunreaktionen, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen und Pilzpathogenese12,13,14,15. Diese Informationen können aus der hochauflösenden Bildgebung von fluoreszierenden Pathogenen und Wirtszellen13,Larvenüberleben und KBE-Persistenz im Laufe der Zeit abgeleitet werden.
Die Mikroinjektionstechnik ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls und muss möglicherweise angepasst werden, wenn verschiedene Mikroinjektionsgeräte und -einstellungen verwendet werden. Insbesondere sind der Druck und die Zeit der Injektion zwei Hauptvariablen und können angepasst werden, um sicherzustellen, dass das von der Nadel ausgeworfene Volumen 3 nL beträgt. Die Größe der Nadel, die durch Clipping mit Zangen bestimmt wird, reguliert auch die Anzahl der Sporen, die injiziert werden; obwohl eine größere Öffnung Gewebeschäden an der Larve verursachen kann. Auf der anderen Seite lässt eine zu kleine Öffnung die relativ großen Sporen (>2 m) nicht heraus und kann zu einer Nadelverstopfung führen. In diesem Fall kann die Nadel zurückgelehnt werden, um eine etwas größere Öffnung zu haben.
Andere Protokolle für die Mikroinjektion von Bakterien nutzen PVP-40, um eine homogene Injektionsmischung aufrechtzuerhalten, aber wir haben keinen Vorteil bei der Verwendung dieses Trägers mit Aspergillus Sporen gefunden. Verstopfung der Nadel kann durch Wirbeln der Pilzzubereitung gründlich gemildert werden, um klumpende Klumpen vor dem Beladen der Nadel zu brechen. Manchmal kann ein Verstopfen in der Nadel auch durch vorübergehende Erhöhung des Drucks oder der Injektionszeit und Auslösen des Mikroinjektors, während sich die Nadel in der Flüssigkeit um die Larven befindet, entfernt werden. Der Druck und die Einspritzzeit sollten dann wieder auf ein früheres Niveau reduziert werden. In anderen Fällen kann ein Verstoclog nicht entfernt werden, und eine neue Nadel muss geladen und neu kalibriert werden.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Sporen pro Larve zu injizieren. Es ist bekannt, dass diese Zahl aufgrund der Konzentration der Sporenzubereitung und des injizierten Volumens recht gering ist. Es wurde jedoch empirisch festgestellt, dass dies die Anzahl der Sporen ist, die unter diesen Bedingungen injiziert werden. Warum dieser Unterschied auftritt, ist unbekannt, aber es kann durch Sporenklumpen in der Nadel sein. Unsere eigenen Versuche, eine größere Anzahl von Sporen zu injizieren, waren weitgehend erfolglos.
Um sicherzustellen, dass etwa 30–70 Sporen injiziert werden und die Konsistenz der Injektionen in allen Larven erhalten bleibt, überprüfen Sie die Anzahl der Sporen, indem Sie die Larven in die E3 einspritzen. Wiederholen Sie dies alle fünf bis sechs Larven während aller Injektionen. Wenn sich die Sporenzahl zu ändern scheint, kann der Druck und/oder die Injektionszeit eingestellt werden, um eine konsistente Anzahl von Sporen über mehrere Larven zu injizieren. Allerdings sollte darauf geachtet werden, dass die Injektionsdosis in erster Linie im Hinterhirn verbleibt und das Mittelhirn und das Vorderhirn nicht füllt.
Um eine lokalisierte Infektion zu gewährleisten, sollte die Sporensuspension in der Hinterhirnkammer enthalten sein. Dies kann durch die phenolrote Färbung kurz nach der Injektion visualisiert werden, obwohl die rote Farbe mit der Zeit diffundiert. Bei Injektionen wird der Bereich um das otische Vesikel verwendet, um den Ventrikel in einem Winkel von 45°–65° zu durchdringen und zu erreichen. Dieser Bereich hat keine Hauptblutgefäße, verursacht weniger Gewebeschäden, und heilt sofort. Wenn die Haut über dem Ventrikel durchbohrt ist, kann die Sporensuspension austreten, da die Nadel, die für Aspergillus Sporeninjektionen verwendet werden muss, größer ist, als die für bakterielle Suspensionen verwendet wird. Erfolglos injizierte oder versehentlich beschädigte Larven können durch Einspritzen in das Eigelb ein paar Mal markiert werden, um eine rote Markierung zu erstellen oder indem die Larve mit der Nadel aus der Reihe gezogen wird. Nachdem ein Satz Von Injektionen abgeschlossen ist, sollten diese Larven entfernt und entsorgt werden, bevor der Rest von der Platte gewaschen wird. E3 ohne Methylenblau wird verwendet, um Larven vor der Injektion zu beächen und auch Larven nach den Injektionen zu halten, da Methylenblau antimykotisch ist.
Zum Zeitpunkt der Injektion stellen die KBE-Zahlen die Anzahl der lebensfähigen Sporen innerhalb des infizierten Wirts dar. Wenn die Sporen jedoch zu Hyphen keimen, können diese während der Homogenisierung in separate lebensfähige “Pilzeinheiten” zerlegt werden und mehrere Kolonien hervorrufen. Oder eine ungebrochene mehrzellige Hypha kann zu einer einzigen Kolonie führen, was zu einer gemittelten, aber ungenauen Darstellung der Pilzlast führt. Dies kann durch die Kombination der KBE-Zahlen mit der Längsmikroskopie einzelner Larven gemildert werden, die visuelle Daten über das Schicksal der injizierten Sporen liefert.
Im Vergleich zum Säugetiersystem ist das Modell der Zebrafischlarveninfektion aufgrund seiner optischen Zugänglichkeit besonders bedeutsam. Die Rekrutierung und Reaktion angeborener Immunzellen kann innerhalb eines intakten Lebenden Wirts visualisiert werden. Dies kann mit genetischer oder chemischer Hemmung molekularer Targets integriert werden, um zu analysieren, wie jedes Ziel die Makrophagen- oder Neutrophilenreaktion gegen Aspergillussporen bei einem lebenden Tier beeinflusst.
Während die Zebrafisch Larve Aspergillus Infektionmodell weiterhin entscheidend bei der Beschreibung verschiedener Aspekte von IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, gibt es andere Bereiche der Expansion. Von der Wirtsseite aus wird es verwendet, um immunikuläre Immunantworten zu beschreiben, aber dies kann erweitert werden, um Immunmechanismen auf molekularer Ebene zu analysieren, indem es mit gezieltem Morpholino, CRISPR, stabilen mutierten Linien oder chemischer Exposition kombiniert wird. Eine Einschränkung ist, dass Homologe für alle bekannten angeborenen Immunwegkomponenten von Säugetieren bei Zebrafischen nicht identifiziert wurden.
Von der Pathogenseite aus wurden Virulenz verschiedener Arten und Stämme beschrieben. Ein vielversprechender Weg zukünftiger Forschung ist die Verwendung mutierter Aspergillus-Stämme, um zu testen, wie bestimmte Gene oder Proteine als Virulenzfaktoren beitragen. Dadurch können neuartige Antimykotika entwickelt werden, um diese Proteine gezielt zu nehmen. Aktuelle Anti-Pilz-Medikamente haben geringe Wirksamkeit bei menschlichen Patienten und es gibt wachsende Resistenz gegen diese Medikamente in Pilzen28. Dieses In-vivo-Modell kann verwendet werden, um zu untersuchen, warum diese Medikamente versagen und als Zwischenmodell, um die Wirksamkeit neuer Anti-Pilz-Medikamente zu testen. Insgesamt können die mit diesem Modell entdeckten Erkenntnisse die zukünftige Entwicklung wirksamer Behandlungen für Aspergillus-infiziertePatienten erleichtern.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy And Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Award-Nummer K22AI134677 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |