Dit protocol beschrijft een Aspergillus infectiemodel in zebravislarven. Aspergillus sporen worden micro-geïnjecteerd in de hindbrain van larven, en chemische behandeling wordt gebruikt om immunosuppressie induceren. Infectieprogressie wordt gecontroleerd via een dagelijkse beeldvormingsopstelling om schimmelgroei en immuunresponsen te monitoren, evenals inventarisatie van levende sporen per kolonievormende eenheidsplating.
Invasieve aspergillose (IA) is een van de meest voorkomende schimmelinfecties bij immuungecompromitteerde personen. Ondanks de beschikbaarheid van antischimmelmiddelen kan IA > 50% mortaliteit veroorzaken bij geïnfecteerde immuungecompromitteerde patiënten. Het is cruciaal om zowel gastheer- als ziekteverwekkerfactoren te bepalen die bijdragen aan de gevoeligheid voor infecties en lage overlevingspercentages bij geïnfecteerde patiënten om nieuwe therapieën te ontwikkelen. Aangeboren immuunreacties spelen een cruciale rol bij de herkenning en klaring van Aspergillus-sporen, hoewel er weinig bekend is over de exacte cellulaire en moleculaire mechanismen. Betrouwbare modellen zijn nodig om gedetailleerde mechanistische interacties tussen de gastheer en de ziekteverwekker te onderzoeken. De optische helderheid en genetische tractabiliteit van zebravislarven maken ze een intrigerend model om gastheer-pathogene interacties van meerdere menselijke bacteriële en schimmelinfecties in een levende en intacte gastheer te bestuderen. Dit protocol beschrijft een larvale zebravis Aspergillus infectie model. Ten eerste worden Aspergillus-sporen geïsoleerd en via micro-injectie in de achterhersenen ventrikel van de zebravis geïnjecteerd. Vervolgens worden chemische remmers zoals immunosuppressieve geneesmiddelen rechtstreeks aan het larvale water toegevoegd. Twee methoden om de infectie in geïnjecteerde larven te controleren worden beschreven, waaronder de 1) homogenisatie van larven voor kolonievormende eenheid (CFU) opsomming en 2) een herhaalde, dagelijkse live beeldvorming. Over het algemeen kunnen deze technieken worden gebruikt om mechanistisch de progressie van Aspergillus-infectie in vivo te analyseren en kunnen ze worden toegepast op verschillende gastheerachtergronden en Aspergillus-stammen om gastheer-pathogene interacties te ondervragen.
Aspergillus fumigatus is een alomtegenwoordige saprofytische schimmel, en de sporen in de lucht zijn zowel binnen als buiten te vinden1. Deze sporen worden door iedereen ingeademd, maar worden effectief verwijderd uit de longen van immunocompetente individuen1,2. Mensen met veranderde longaandoeningen zoals cystische fibrose kunnen echter bronchopulmonale aspergillose ontwikkelen als gevolg van schimmelkieming in de longen3. De ernstigste vorm van deze infectie, invasieve aspergillose (IA), treft immuungecompromitteerde individuen en omvat de groei van de schimmel in andere organen2,3. IA leidt tot >50% dood van geïnfecteerde patiënten ondanks de beschikbaarheid van antischimmeltherapieën4. Bij immunocompetente individuen spelen aangeboren immuunresponsen een belangrijke rol bij het opruimen van de geïnhaleerde sporen1. De specifieke mechanismen die bijdragen aan deze aangeboren immuunklaring zijn echter niet goed begrepen. Het is belangrijk om de cellulaire en moleculaire mechanismen van belangrijke aangeboren immuuncellen (d.w.z. macrofagen en neutrofielen) te begrijpen bij de klaring van Aspergillus om nieuwe therapeutische strategieën voor IA te vinden.
Hoewel zoogdiermodellen een belangrijke rol hebben gespeeld bij het identificeren van schimmelvirulentiefactoren en immuunresponsen van gastheer5,6, is de visuele toegankelijkheid beperkt voor interacties tussen gastheer en ziekteverwekker op cellulair niveau. Weefselkweekexperimenten kunnen de complexe multicellulaire omgeving en interacties die bij hele dieren bestaan niet volledig samenvatten7. Daarom is zebravis populair geworden als alternatief modelorganisme om deze kloof op te vullen en de studie van gastheer-pathogene interacties in een levende, intacte gastheer over een meerdaagse infectie8,9tevergemakkelijken . Het aangeboren immuunsysteem van zebravissen ontwikkelt zich al 24 uur na de bevruchting (hpf)10, en het adaptieve systeem duurt 4-6 weken omer 11te ontwikkelen , wat een tijdsvenster biedt waarin aangeboren immuunresponsen afzonderlijk kunnen worden beoordeeld. Aangeboren immuunresponsen zijn goed bewaard gebleven tussen mensen en zebravissen11. Zebravissen hebben veel kwaliteiten die het onderzoek van deze reacties vergemakkelijken, waaronder optische helderheid (die de hoge resolutie live beeldvorming van intacte gastheren mogelijk maakt) en genetische tracteerbaarheid (wat moleculaire mechanistische studies vergemakkelijkt).
De larvale zebravis Aspergillus infectie model hier beschreven werd oorspronkelijk ontwikkeld door Knox et al.12. Het is onlangs uitgebreid door onze groep en anderen om gastheer immuunmechanismen12,13,gastheer-pathogeneinteracties13, 14,15, mechanismen van immunosuppressie13,16,17,schimmel virulentie18,en anti-schimmel drug werkzaamheid19,20te onderzoeken . Dit model vat meerdere aspecten van menselijke aspergillose samen. Hoewel immunocompetente larven resistent zijn, kunnen immuungecompromitteerde larven bezwijken aan infectie12,13,16,17.
In dit model wordt een gelokaliseerde infectie vastgesteld door sporen in de achterhersenen ventrikel van larve te injecteren, een gebied dat minder bevolkt is met fagocyten, en fagocyt rekrutering en gedrag kunnen worden geëvalueerd12,13. Er wordt aangenomen dat macrofagen fungeren als de eerste verdedigingslinie tegen Aspergillus-sporen bij mensen1 en zoogdiermodellen6,21. Evenzo worden in het zebravismodel macrofagen gerekruteerd voor de geïnjecteerde Aspergillus-sporen, terwijl neutrofielen op de tweede plaats worden gerekruteerd als reactie op hyphalgroei12,13,22. Van dit model, het is ook geleerd dat Aspergillus kan blijven in wildtype immunocompetente larven na meer dan 7 dagen van infectie. Bovendien kan het hele verloop van de infectie bij dezelfde levende dieren worden gevolgd door dagelijkse confocale beeldvorming.
Dit protocol beschrijft de techniek van micro-injectie om sporen in de achterhersenen van 2 dagen na bevruchting (2 dpf) larven te injecteren. De infectie wordt vervolgens tot 7 dagen gecontroleerd, omdat zebravislarven tot 10 dpf kunnen leven zonder zich te voeden. Immunosuppressie kan worden geïnduceerd door medicamenteuze behandeling en de toepassing van geneesmiddelen op de larven wordt ook beschreven. Ten slotte worden twee methoden beschreven om infectieprogressie te volgen, waaronder kwantificering van CFUs van individuele larven en een dagelijkse live imaging-opstelling.
Het hier beschreven infectiemodel is gunstig voor het analyseren van de immuunresponsen van de gastheer, interacties tussen gastheer en pathogene ziekteverwekkers en schimmelpathogenese12,13,14,15. Deze informatie kan worden afgeleid uit de hoge resolutie beeldvorming van fluorescerende pathogenen en gastheercellen13,larvale overleving en CFU persistentie in de loop van de tijd.
De micro-injectietechniek is van cruciaal belang voor het succes van dit protocol en moet mogelijk worden aangepast bij het gebruik van verschillende micro-injectieapparatuur en -opstellingen. In het bijzonder zijn de druk en het tijdstip van injectie twee belangrijke variabelen en kunnen worden aangepast om ervoor te zorgen dat het volume dat door de naald wordt uitgeworpen ~ 3 nL is. De grootte van de naald zoals bepaald door het te knippen met een tang reguleert ook het aantal sporen dat wordt geïnjecteerd; hoewel een grotere opening weefselschade aan de larve kan veroorzaken. Aan de andere kant zal een te kleine opening de relatief grote sporen (>2 μm) niet naar buiten laten en kan leiden tot naaldverstopping. Als dit gebeurt, kan de naald opnieuw worden vastgeklemd om een iets grotere opening te hebben.
Andere protocollen voor micro-injection van bacteriën gebruiken PVP-40 om te helpen handhaven van een homogene injectie mengsel, maar we hebben geen voordeel gevonden in het gebruik van deze drager met Aspergillus sporen. Verstopping van de naald kan worden verholpen door het schimmelpreparaat grondig te vortexen om eventuele klonten te breken voordat de naald wordt geladen. Soms kan een verstopping in de naald ook worden losgemaakt door de druk of injectietijd tijdelijk te verhogen en de micro-injector te activeren terwijl de naald zich in de vloeistof rond de larven bevindt. De druk en injectietijd moeten dan opnieuw worden verlaagd tot eerdere niveaus. In andere gevallen kan een verstopping niet worden verwijderd en moet een nieuwe naald worden geladen en opnieuw worden gekalibreerd.
Dit protocol is ontworpen om ~30-70 sporen per larve te injecteren. Het is bekend dat op basis van de concentratie van het sporenpreparaat en het geïnjecteerde volume, dit aantal vrij laag is. Er is echter empirisch vastgesteld dat dit het aantal sporen is dat onder deze omstandigheden wordt geïnjecteerd. Waarom dit verschil optreedt is onbekend, maar het kan te wijten zijn aan sporen die in de naald klonteren. Onze eigen pogingen om grotere aantallen sporen te injecteren zijn grotendeels mislukt.
Om ervoor te zorgen dat ongeveer 30-70 sporen worden geïnjecteerd en de consistentie van de injecties in alle larven te behouden, controleert u het aantal sporen door te injecteren op de E3 rond de larven. Herhaal dit elke vijf tot zes larven tijdens alle injecties. Als het aantal sporen lijkt te veranderen, kan de druk en/of injectietijd worden aangepast om een consistent aantal sporen over meerdere larven te injecteren. Er moet echter voor worden gezorgd dat de injectiedosis voornamelijk in de achterhersenen blijft en de middenhersenen en voorhersenen niet vult.
Om een gelokaliseerde infectie te garanderen, moet de sporensuspensie in de ventrikel van de achterhersenen worden opgenomen. Dit kan worden gevisualiseerd door de fenolrode kleuring net na de injectie, hoewel de rode kleur met de tijd verspreidt. Voor injecties wordt het gebied rond het blaasje gebruikt om de ventrikel onder een hoek van 45°–65° door te prikken en te bereiken. Dit gebied heeft geen hoofdbloedvaten, veroorzaakt minder weefselschade en geneest onmiddellijk. Als de huid over de ventrikel wordt doorboord, kan de sporensuspensie worden uitgelekt, omdat de naald die moet worden gebruikt voor Aspergillus-sporeninjecties groter is dan die wordt gebruikt voor bacteriële suspensus. Tevergeefs geïnjecteerde of per ongeluk beschadigde larven kunnen worden gemarkeerd door een paar keer in de dooier te injecteren om een rode markering te creëren of door de larve met de naald uit de rij te slepen. Nadat een set injecties is voltooid, moeten deze larven worden verwijderd en verwijderd voordat de rest van de plaat wordt gewassen. E3 zonder methyleenblauw wordt gebruikt om larven voorafgaand aan de injectie te verdoven en ook de larve na de injecties te houden, omdat methyleenblauw antischimmel is.
Op het moment van injectie vertegenwoordigen CFU-tellingen het aantal levensvatbare sporen in de geïnfecteerde gastheer. Als de sporen echter ontkiemen tot hyphae, kunnen deze tijdens homogenisatie worden opgesplitst in afzonderlijke levensvatbare “schimmeleenheden” en kunnen ze aanleiding geven tot meerdere kolonies. Of een ononderbroken meercellige hypha kan aanleiding geven tot een enkele kolonie, wat resulteert in een gemiddelde, maar onnauwkeurige weergave van de schimmellast. Dit kan worden verzacht door de CFU-tellingen te combineren met longitudinale microscopie van individuele larven, die visuele gegevens biedt over het lot van geïnjecteerde sporen.
In vergelijking met het zoogdiersysteem is het infectiemodel van de zebravislarve bijzonder belangrijk vanwege de optische toegankelijkheid. De rekrutering en respons van aangeboren immuuncellen kan worden gevisualiseerd in een levende intacte gastheer. Dit kan worden opgenomen met genetische of chemische remming van moleculaire doelen om te analyseren hoe elk doelwit de macrofaag of neutrofiele reactie tegen Aspergillus-sporen bij een levend dier beïnvloedt.
Terwijl de zebravis larve Aspergillus infectie model blijft instrumenteel in het beschrijven van verschillende aspecten van IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, er zijn andere gebieden van uitbreiding. Vanaf de gastheerzijde wordt het gebruikt om immuunresponsen op cellulair niveau te beschrijven, maar dit kan worden uitgebreid om immuunmechanismen op moleculair niveau te analyseren door het te combineren met gerichte morfolino, CRISPR, stabiele mutantlijnen of chemische blootstelling. Een kanttekening is dat homologues voor alle bekende aangeboren immuunwegcomponenten van zoogdieren niet zijn geïdentificeerd bij zebravissen.
Van de pathogene kant is virulentie van verschillende soorten en stammen beschreven. Een veelbelovende manier van toekomstig onderzoek is het gebruik van mutante Aspergillus stammen om te testen hoe specifieke genen of eiwitten bijdragen als virulentie factoren. Daardoor kunnen nieuwe antischimmelmiddelen worden ontwikkeld om deze eiwitten aan te pakken. Huidige antischimmelmiddelen hebben een lage werkzaamheid bij menselijke patiënten en er is een groeiende resistentie tegen deze geneesmiddelen bij schimmels28. Dit in vivo model kan worden gebruikt om te onderzoeken waarom deze geneesmiddelen falen en als tussenmodel om de werkzaamheid van nieuwe antischimmelmiddelen te testen. Over het algemeen kunnen de bevindingen die met behulp van dit model worden ontdekt, de toekomstige ontwikkeling van effectieve behandelingen voor met Aspergillusgeïnfecteerde patiënten vergemakkelijken.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Allergy And Infectious Diseases van de National Institutes of Health onder awardnummer K22AI134677. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.
Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Agarose | Fisher | BP160-500 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
Media and Solutions | Components/Recipe | ||
E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |