cDNA’nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
RNA bağlayıcı proteinler (RBP’ler) ve RNA substratları arasındaki etkileşim, akışkanlık ve karmaşıklık gösterir. Yaşam süresi boyunca, tek bir RNA, üretimini, kararlılığını, aktivitesini ve bozulmasını düzenleyecek birçok farklı RBP tarafından bağlanabilir. Bu nedenle, bu iki molekül türü arasında var olan dinamikleri anlamak için çok şey yapılmıştır. Özellikle önemli bir atılım, ‘cross-l mürekkepleme ve immunoprecipitation’ (CLIP) ortaya çıkmasıyla geldi. Bu teknik, hangi RNA’ların belirli bir RBP tarafından bağlandığına dair sıkı bir araştırmaya izin verdi. Kısacası, ilgilenilen protein, RNA substratlarına in vivo olarak çapraz bağlanmış, oldukça katı koşullar altında saflaştırılmış UV’dir ve daha sonra proteine kovalent olarak çapraz bağlanmış RNA’lar cDNA kütüphanelerine dönüştürülür ve sıralanır. Kuruluşundan bu yana, CLIP’yi belirli çalışma alanlarına uygun hale getirmek için birçok türev teknik geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ultraviyole ışık kullanarak çapraz bağlama, bilinen bir şekilde verimsizdir. Bu, RBP-RNA etkileşimlerinin zamansal çalışmasını imkansız kılan uzun maruz kalma süreleri ile sonuçlanır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, yakın zamanda çok daha gelişmiş UV ışınlama ve hücre toplama cihazları tasarladık ve ürettik. Bu yeni araçları kullanarak, canlı hücrelerdeki RBP-RNA etkileşimlerinin yüksek zamansal çözünürlükte zamana bağlı analizleri için bir protokol geliştirdik: Kinetik CRoss bağlantısı ve cDNA’larının (χCRAC) birnalizi. Son zamanlarda bu tekniği, maya RBP’lerinin besin stresi adaptasyonundaki rolünü incelemek için kullandık. Bu makalede χCRAC yöntemine ayrıntılı bir genel bakış sunulmakta ve Nrd1 RBP ile elde edilen son sonuçlar sunulmaktadır.
RNA’lar genellikle işlevlerini yerine getirmek için RBP’lere güvenirler, bu da bu moleküller arasındaki dinamikleri anlamaya büyük ilgi duymuştur. Birçok RBP, çok çeşitli organizmalarda tanımlanmıştır. Bununla birlikte, RBP-RNA etkileşimlerini in vivo olarak incelemek her zaman zor olmuştur. Bu tür etkileşimlerin incelenmesinde büyük bir atılım, CLIP1’in ortaya çıkmasıyla geldi. Bu yöntem, RBP’ler ve doğrudan bağlı RNA’ları arasındaki kovalent bağları (yani, sıfır mesafeli çapraz bağlama) indüklemek için ultraviyole (UV, 254 nm) ışınlamasını kullanır. Daha sonra, ilgilenilen RBP, yalnızca proteinlere kovalent olarak çapraz bağlı RNA’ların tanımlanmasını sağlamak için sıkı koşullar altında immünosaflaştırılır. Bağlı RNA’lar daha sonra RNazlarla kısmen sindirilir ve daha sonra dizileme için cDNA kütüphanelerine dönüştürülür. Yüksek saflaştırma sıkılığı, çapraz bağlı ribonükleoprotein (RNP) kompleksinin SDS-PAGE saflaştırılmasıyla daha da geliştirilen protein ve RNA geri kazanımının özgüllüğünü büyük ölçüde arttırdığı için önemlidir. CLIP ve ilgili yöntemler ayrıca protein bağlanma bölgesine nükleotid çözünürlüğü anlayışı sağlar, çünkü dizileme kütüphanesinin hazırlanması sırasında, RNA’ya çapraz bağlanan amino asitler sıklıkla ters transkriptazı sonlandırır veya enzimin bu bölgede mutasyonlar oluşturmasına neden olur 1,2,3.
Tanıtılmasından bu yana, orijinal CLIP protokolü dikkate değer çeşitlilikte türev metodolojileri üretmiştir. Özellikle önemli bir atılım, yüksek verimli sıralamayı CLIP yaklaşım3 ile birleştiren HITS-CLIP’in (veya CLIP-seq) geliştirilmesiyle geldi. Bu, o zamandan beri tüm CLIP tabanlı metodolojiler tarafından benimsenmiştir. iCLIP, RBP bağlama bölgelerinin daha doğru haritalanmasını kolaylaştıran RNase aracılı kırpma ve adaptör ligasyon tekniklerinde iyileştirmeler getirmiştir4. PAR-CLIP, 4tiyo-idrar / urasil etiketlemeyi 365 nm’de çapraz bağlama ile birleştirerek, T-C ikamelerini analiz ederek çapraz bağlama bölgelerini haritalamayı mümkün kıldı5. CRAC, üre-iCLIP, dCLIP ve uvCLAP, afinite reçinesine arka plan bağlanmasını daha da azaltan ve protein yakalama 2,6,7,8,9’un özgüllüğünü daha da artıran denatüre etme koşulları ve çift afinite saflaştırma adımları getirmiştir. Ek olarak, CRAC, uvCLAP ve dCLIP, ilgilenilen RBP’yi bir afinite etiketi ile etiketlemeyi tanıttı, böylece spesifik antikorlar üretme ihtiyacının üstesinden geldi.
CLIP metodolojisini hızlandırmak için çeşitli optimizasyonlar da yapılmıştır. Orijinal CLIP protokolü, SDS-PAGE’den sonra RBP-RNA komplekslerini görselleştirmek için yakalanan RNA’ların radyoetiketlemesini kullandı. Bununla birlikte, radyoaktivite kullanımı, bu tür çalışmalar için kurulmamış laboratuvarlar için sorunlu olabilir. irCLIP, kızılötesi görüntüleme10 yoluyla görselleştirmeyi kolaylaştıran florofor kuplajlı bir adaptör içerir ve sCLIP, streptavidin konjuge HRP11 aracılığıyla görselleştirmek için yakalanan RNA’ların biyotinilasyonunu kullanır. Ayrıca, eCLIP RNA etiketlemesinden tamamen vazgeçer; bunun yerine, protein sadece bilinen büyüklüğüne göre eksize edilir12. Streptavidin bazlı saflaştırma, biyotinillenmiş bir 3′ adaptörün RNA’lara bağlandığı ve ters transkripsiyon ve daireselleştirme13’ten sonra saflaştırmayı sağlamak için kullanıldığı FAST-iCLIP’de kütüphane hazırlama sürecini hızlandırmak için de kullanılmıştır. iCLIP protokolündeki ek geliştirmeler de kütüphanelerin karmaşıklığını büyük ölçüde artırdı4.
Son olarak, CLIP, RBP’lerin farklı hücresel alt bölmelerden 14,15’ten yakalanmasını sağlamak, fotoaktive edilebilir ribonükleozitlerindarbeli indüksiyonu kullanılarak yeni transkribe edilmiş RNA’ları görselleştirmek için 5,16,17, metillenmiş RNA’ları yakalamak için18,19,20, RNA-RNA etkileşimlerini incelemek21,22 ve 3′ uçlarını haritalamak için modifiye edilmiştir 23,24.
RBP’ler ve RNA’lar arasındaki etkileşimleri anlamamıza yardımcı olan CLIP tabanlı tekniklerin büyük katkılarına rağmen, UV çapraz bağlamanın verimsizliği ile sınırlandırılmıştır. Tek katmanlı bir tabakada yetiştirilen kültür hücrelerinin çapraz bağlanması genellikle nispeten kolay olsa da, bu dokularda veya çözeltideki hücrelerde önemli ölçüde daha zordur. Dokular, gerekli hücre katmanlarına nüfuz etmek için birden fazla UV maruziyeti turu gerektirebilirken, mikrobiyal hücreler genellikle aromatik, UV emici bileşikler içeren zengin ortamlarda yetiştirilir25. Gerçekten de, bu tür örnekler için RBP’ler ve bağlı RNA’ları arasında yeterli çapraz bağlantı oluşturmak için 30 dakikaya kadar UV ışınlama süreleri kullanılmıştır26,27,28. Bu genişletilmiş UV maruziyeti, hücre içinde, bazı uygulamalarda nihai verileri kirletebilecek UV kaynaklı DNA hasarı gibi stres tepkilerini indükler.
CLIP çalışmalarının çoğu, bir hücredeki spesifik protein-RNA etkileşimlerinin tek bir “anlık görüntüsünü” üretmeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, protein-RNA etkileşimleri, özellikle hücreler çevrelerinde değişikliklere maruz kaldıklarında doğal olarak dinamiktir. Bu, temel besin maddelerinin mevcudiyetinde ani bir azalma veya sıcaklıktaki hızlı değişiklikleri içerebilir. Bu nedenle, stres sırasında bir RBP’nin rolünü gerçekten anlamak için, zamana bağlı analizler yapmak en iyisidir, çünkü stres sırasında RBP hedeflerinin tüm spektrumunu yakalayabilir ve seçilen RBP’nin stres tepkisinin hangi aşamasında aktif olduğunu belirleyebilirler. Özellikle, mayadaki çalışmalar, adaptasyonun ilk birkaç dakikasının hayatta kalmak için kesinlikle çok önemli olduğunu ve bakterilerdeki RNA yarı ömrünün dakikalardan saniyelere kadar değişebileceğini göstermiştir 29,30,31,32,33. Bu nedenle, bu tür zaman çözümlü analizler ideal olarak yüksek zamansal çözünürlükte yapılmalıdır. Bununla birlikte, uzun çapraz bağlama süreleri, erken aşama adaptif yanıtların incelenmesini özellikle zorlaştırmaktadır.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, yakın zamanda hücreleri dakikalarca süren zaman dilimlerinde çapraz bağlayabilen ve toplayabilen gelişmiş bir yöntem geliştirdik. χCRAC yöntemimiz, RBP-RNA etkileşimlerindeki dinamik değişikliklerin daha önce tanık olunmamış çözünürlükte nicel olarak ölçülmesini sağlar. Bu yöntem için çok önemli olan, çözeltideki maya ve bakterilerde gerekli çapraz bağlanma süresini yaklaşık 10 kat azaltan ve RBP-RNA etkileşimlerini anında etkili bir şekilde donduran yeni bir UV ışınlama cihazı32’nin geliştirilmesiydi. Ek olarak, UV ışınlamasından sonra hücreleri hızlı bir şekilde toplamak için, yaklaşık 30 s32’de 0.5 L’lik bir kültürde katlanarak büyüyen mayayı hasat edebilen bir vakum filtrasyon cihazı geliştirdik. Bu teknolojik yenilikler, RBP-RNA dinamiklerinin dakika ölçeğinde çözünürlükte incelenmesine izin verir. Ek olarak, pratikliğini artırmak için orijinal CRAC protokolü2’ye çeşitli optimizasyonlar da getirdik.
χCRAC kullanarak, yakın zamanda glikoz yoksunluğuna yanıt olarak bir maya nükleer RBP’si olan Nab3’ün hedefini inceledik. Saccharomyces cerevisiae’de Nab3, NNS kompleksini oluşturmak için Nrd1, bir RBP ve RNA helikaz Sen1 ile bir kompleks oluşturabilir. RNA polimerazına ve yeni ortaya çıkan transkripte NNS’nin bağlanması, transkripsiyonel sonlandırmayı tetikleyebilir34. Bu kompleks çoğunlukla şifreli kodlamayan RNA transkriptlerinin çıkarılmasında rol oynar, ancak protein kodlayan genlerin ekspresyonunu düzenlediği de gösterilmiştir. Çalışma, Nab3’ün sadece bir dakikalık stresten sonra kodlamayan ve kodlamayan transkriptlere diferansiyel hedeflemesini gösterdi32. Nab3 ile ko-transkripsiyonel sonlandırmanın, retrotranspozon genlerinin çok geçici, nabız benzeri bir ekspresyonu ile sonuçlandığını ve geleneksel CLIP tabanlı yaklaşımlar kullanılarak tespit edilmesinin zor olacağını gösterdik. Ek olarak, UV çapraz bağlayıcımızdaki kısa UV ışınlama süreleri, kısa ömürlü kodlamayan RNA’ların geri kazanımını da önemli ölçüde artırdı32. χCRAC muhtemelen RBP’lerin strese verilen tepkiyi anlık zaman ölçeklerinde nasıl şekillendirdiğini değil, aynı zamanda bir yanıtın tüm yaşam döngüsü boyunca değişen rollerini de aydınlatmada çok önemli bir araç olacaktır. Bu makale, χCRAC protokolündeki tüm adımlara ayrıntılı bir genel bakış sunmaktadır. Açıklayıcı amaçlar için, yöntem, transkripsiyonel sonlandırma ve RNA bozunumunda35,36 ile ilgili olan maya Nrd1 proteinini ve çok sayıda zaman noktasında glikoz yoksunluğuna yanıt olarak RNA hedefomunu incelemek için kullanıldı. Son olarak, UV ışınlama ünitemizin RBP’leri HeLa hücrelerinde RNA’ya hızlı bir şekilde çapraz bağlayabildiğini ve yapışkan hücrelerde yüksek çözünürlüklü zaman çözümlü analizler yapmayı mümkün kıldığını da gösteriyoruz.
Yeni çapraz bağlama ve hücre toplama cihazlarıyla birleştirilen χCRAC yöntemi, çok çeşitli model organizmalara uygulanabilir olduğu ve bu nedenle RNA alanına genel ilgi göstermesi gerektiği için büyük bir potansiyele sahiptir. χCRAC’ın kullanılabileceği birçok alan vardır. Örneğin, yöntem, proteinlerin hiyerarşik montajını, genellikle proteinler ve RNA molekülleri arasındaki dinamik etkileşimleri içeren splisozom ve ribozom gibi büyük makromoleküler komplekslere ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, hücreler çeşitli streslere maruz kaldıklarında RNA bozunma faktörleri ve substratları arasındaki etkileşimleri izlemek için rutin olarak kullanıyoruz. Bu, adaptif yanıtın hangi aşamasında bu faktörlerin en aktif olduğunu, hangi substratlara bağlandıklarını ve bu etkileşimlerin ne kadar dinamik olduğunu belirlememizi sağlar. Bu tür veriler, araştırmacıların çevresel değişikliklere adaptasyonda her bir faktörün göreceli katkısını belirlemelerini sağlamalıdır.
χCRAC, proteini son derece sıkı ve denatüre edici koşullar altında saflaştırmak için çift afiniteli saflaştırma etiketleri (HTF veya HTP) kullanır. Bu, kosafifiye RNA’nın, ilgilenilen proteine kovalent olarak çapraz bağlanmış RNA’lar için yüksek oranda zenginleştirilmesini sağlar. Ancak, benzeşim etiketlerine güvenmenin dezavantajları vardır. Örneğin, etiket protein fonksiyonuna müdahale edebilir, bu da RNA bağlayıcı interaktomunun çarpık bir okumasını verebilir. Ek olarak, bazı model organizmalar için etiketleri kullanmak her zaman mümkün olmayabilir, çünkü DNA parçalarını genoma entegre etmek veya ekspresyon plazmidlerini dönüştürmek için genetik araçlar henüz mevcut değildir. Bununla birlikte, χCRAC protokolünün bazı bölümlerini, RBP’nin saflaştırılması için antikorlara dayanan CLIP tabanlı protokollerle uyumlu hale getirmek için değiştirmek kolaydır. Gerçekten de, bu çalışma iCLIP bazlı saflaştırmaları çapraz bağlayıcımızla birleştirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Şimdi, insan RNA bağlayıcı proteinlerinin yeni ortaya çıkan RNA transkriptleriyle zamansal ilişkisini incelemek için CLIP protokolleri geliştirme sürecindeyiz.
Yeni bir protein üzerinde χCRAC gerçekleştirirken, maksimum çapraz bağlanmayı indüklemek için UV maruziyeti optimize edilmelidir. Bu önemlidir, çünkü yüksek UV maruziyeti, saflaştırma adımı sırasında RNA’nın geri kazanımını azaltabilir. Rekombinant RBP’yi eksprese eden hücreler çeşitli UV dozlarına, 100 mJ / cm2, 250 mJ / cm2, 500 mJ / cm2 ve 1 J /cm2’ye maruz bırakıldı. RNP’ler daha sonra yakalandı ve RNA’lar parçalandı ve radyo-etiketlendi. Daha sonra, RNP’ler SDS-PAGE tarafından çözüldü ve hangi maruziyetin en yoğun sinyali verdiğini (yani maksimum çapraz bağlama) çıkarmak için bir otoradyogram alındı.
Deney koşulları optimize edildikten sonra, χCRAC gerçekleştirilirken birkaç kontrol deneyi önerilir. İlk olarak, saflaştırma boncuklarına arka plan bağlanmasını izlemek için UV ışınlanmış, etiketlenmemiş bir numune kullanılabilir. İkincisi, bir vardiya deneyi sırasında χCRAC uygulanırken, hücrelerin orijinal ortama geri kaydırıldığı ikinci bir zaman serisi, hücrelerin filtrasyonunun kendisinin RNA seviyelerinde veya protein-RNA etkileşimlerinde değişikliklere neden olup olmadığının araştırılmasını sağlar.
Giriş’te belirtildiği gibi, yakın zamanda yayınlanmış çok sayıda makale, CLIP protokolünde bir dizi optimizasyon önermektedir. Bu, kızılötesi tarama10 yoluyla protein-RNA kompleksini tespit etmek için floresan olarak etiketlenmiş adaptörlerin kullanımını ve ayrıca ortaya çıkan kütüphanelerin karmaşıklığını arttırdığı gösterilen çeşitli nükleik asit saflaştırma ve boyut seçim adımlarına optimizasyonları içerir12,45. Şu anda χCRAC protokolünü daha da hassaslaştırmak için bu iyileştirmelerden bazılarını uyguluyoruz. Burada sunulan protokol, verilerin karmaşıklığını artıran orijinal CRAC ve χCRAC protokollerinde bir dizi iyileştirme içermektedir. Örneğin, daha önce, SDS-PAGE jelleri üzerindeki çapraz bağlı, radyoaktif protein-RNA komplekslerini çözdükten sonra, bir nitroselüloz membranına aktarıldı ve çapraz bağlı RNA lekeden izole edildi. Bununla birlikte, RNP’nin transferi ve ardından RNA ekstraksiyonu, özellikle RNA polimeraz alt birimleri gibi büyük RBP’lerle uğraşırken çok verimsiz olabilir. Bu, çapraz bağlı RNA’nın geri kazanımında önemli bir azalmaya neden olabilir. Mevcut protokolde, çapraz bağlı RNA, Şekil 1’de gösterildiği gibi doğrudan SDS-PAGE jel dilimlerinden ekstrakte edilir. Bu, çapraz bağlı RNA’ların geri kazanımını arttırdı. Ek olarak, cDNA’ların PCR amplifikasyonundan sonra, ürün başlangıçta% 3, düşük erime sıcaklıklı agaroz jelleri üzerinde çözüldü ve daha sonra jelden 175-300 bp PCR ürünleri ekstrakte edildi. Bununla birlikte, bu jeller kolayca aşırı yüklenebilir ve bu da DNA’nın çok zayıf bir şekilde ayrılmasına neden olur. Agaroz jellerinin prekast TBE jellerle değiştirilmesi, daha tutarlı boyut ayrımı ve PCR ürünlerinin daha iyi geri kazanılması ile sonuçlandı.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Wellcome Trust (091549 S.G.’ye ve 109093/Z/15/A’dan S.M.’ye), Wellcome Trust Centre for Cell Biology çekirdek hibesi (092076) ve Tıbbi Araştırma Konseyi Klinik Olmayan Kıdemli Araştırma Bursu (MR/R008205/1’den S.G.’ye), Avrupa Moleküler Biyoloji Örgütü’nden uzun süreli doktora sonrası burs (ALTF 1070-2017’den R.A.C.’ye) tarafından desteklenmiştir. ve Danimarka Bağımsız Araştırma Fonu (T.H.J).
1,4-dithioreitol | Merck | 10708984001 | Buffer component in mammalian cell lysis |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | General reaction tube |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | For holding columns and collection of waste |
32P-yATP | Perkin Elmer | NEG502Z-250 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
4-12% Bis-Tris gel | Invitrogen | NP0321BOX | SDS-PAGE gel |
4X loading buffer | Novex | NP0008 | Protein loading dye concentrate |
50 bp ladder | New England Biolabs | N3236 | Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library |
50% PEG | NEB | B100045 | For the L5 linker ligation |
6% TBE gel | Invitrogen | EC6265BOX | For separation and purification of the cDNA library |
Acetone | ACROS Organics | 423245000 | Washing of TCA-precipitated proteins |
anti-FLAG beads | Sigma Aldrich | M8823-1ML | For purifcation of FLAG-tagged RBPs |
ATP (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0441 | For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs |
Beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | Buffer component |
Biomax MS intensifying screen | Sigma Aldrich | Z363162-1EA | For intensifying the autoradiogram signal |
Chloroform | Thermo Fisher Scientific | 1010219 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | For inhibition of cellular proteases after lysis |
Complete supplement mixture -TRP | Formedium | DCS0149 | For preparation of synthetic defined medium |
Costar Spin-X 0.22 µm filters | Sigma Aldrich | CLS8160 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
DNase RQ1 | Promega | M6101 | For DNA digest following cell lysis |
dNTPs (10 mM) | Sigma Aldrich | 4638956001 | For reverse transcription and PCR |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10041814 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen | AM9261 | For protease K buffer |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293 | For degradation of primers following PCR |
Glass microfiber filters | Whatman | 1823-010 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
Glucose | Formedium | GLU03 | For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium |
Glycogen (20 mg/mL) | Roche | 10901393001 | Precipitation of proteins, RNA and DNA |
GST-TEV | Homemade | Construct and purification protocol is available upon request | |
Guanidium hydrochloroide | Thermo Fisher Scientific | 10071503 | Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer |
IgG beads | GE Healthcare | 17-0969-01 | For purification of protein A-tagged RBPs |
Imidazole | Sigma Aldrich | I2399-100G | For elution of captured proteins from Nickel beads |
Isoamyl alcohol | Thermo Fisher Scientific | A393-500 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Luna Universal One-Step RT-qPCR | NEB | E3005S | For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles |
Magnesium chloride | Fluka Analytical | 63020-1L | For PNK buffer |
Membrane filters | Millipore | AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria | For vacuum filtration of cells |
Micro bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | For collecting eluate after gel extraction |
Ni-NTA beads | Qiagen | 30210 | For secondary protein capture |
NP-40 | Sigma Aldrich | I8896-100ML | Buffer component |
Pfu polymerase | Promega | M7741 | For amplification of the cDNA library |
Phenol | Sigma Aldrich | P4682-400ML | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Pierce spin columns | Thermo Fisher Scientific | 69725 | For on-column enzymatic reactions |
Protease K | Roche | 3115887001 | For degradation of the RBP following gel extraction |
Quartz Petri dish | UVO3 | N/A | For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP |
Radiography films | Amersham | 28906843 | For autoradiography visualisation |
RNAClean XP beads | Beckmann | A63987 | SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs |
RNase H | New England Biolabs | M0297 | For degradation of RNAs following reverse transcription |
RNase-It | Agilent | 400720 | For RNA digestion |
rRNasin | Promega | N2511 | For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889-1KG | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | Buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-100G | Buffer component in mammalian cell lysis |
Sodium dodecylsulfate | Sigma Aldrich | L3771-1KG | For protease K buffer |
SUPERase-In | Invitrogen | AM2694 | For inhibition of cellular RNases after lysis |
SuperScript IV | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | For reverse transcription |
T4 PNK | New England Biolabs | M0201 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204 | For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end |
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q | NEB | M0351S | For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs |
TBE buffer (10X) | Invitrogen | 15581-028 | For running TBE gels |
TEV protease | Homemade | For eluting captured proteins following FLAG capture | |
Thermosensitive alkaline phosphatase | Promega | M9910 | For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs |
Trichloroacetic acid (100%) | Sigma Aldrich | T0699-100ML | For precipitation of RBP-RNA complexes |
Tris hydrochloride | Invitrogen | 15504-020 | Buffer component |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | Buffer component in mammalian cell lysis |
Vari Filter | UVO3 | N/A | Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP |
Vari-X-Linker | UVO3 | N/A | Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP |
Yeast nitrogen base | Formedium | CYN0410 | For preparation of synthetic defined medium |
Zirconia beads | Thistle | 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria | For cell lysis via bead beating |