JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Published: May 09, 2020
doi:
10.3791/61027
, , , , , , , , ,
1Centre for Engineering Biology,University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology,University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics,Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

Summary

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Abstract

De interactie tussen RNA-bindende eiwitten (RBP’s) en hun RNA-substraten vertoont vloeibaarheid en complexiteit. Binnen zijn levensduur kan een enkel RNA worden gebonden door veel verschillende RBP’s die de productie, stabiliteit, activiteit en afbraak zullen reguleren. Als zodanig is er veel gedaan om de dynamiek tussen deze twee soorten moleculen te begrijpen. Een bijzonder belangrijke doorbraak kwam met de opkomst van ‘cross-l inking and immunoprecipitation’ (CLIP). Deze techniek maakte streng onderzoek mogelijk naar welke RNA’s gebonden zijn aan een bepaald RBP. Kortom, het eiwit van belang is UV-cross-linked met zijn RNA-substraten in vivo, gezuiverd onder zeer strenge omstandigheden, en vervolgens worden de RNA’s die covalent aan het eiwit zijn gekoppeld, omgezet in cDNA-bibliotheken en gesequenced. Sinds de conceptie zijn er veel afgeleide technieken ontwikkeld om CLIP ontvankelijk te maken voor bepaalde vakgebieden. Cross-linking met behulp van ultraviolet licht is echter notoir inefficiënt. Dit resulteert in langere blootstellingstijden die de temporele studie van RBP-RNA-interacties onmogelijk maken. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs sterk verbeterde UV-bestralings- en celoogstapparaten ontworpen en gebouwd. Met behulp van deze nieuwe tools ontwikkelden we een protocol voor tijd-opgeloste analyses van RBP-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie: Kinetic CRoss-linking en Analysis of cDNAs (χCRAC). We hebben deze techniek onlangs gebruikt om de rol van gist-RBP’s bij de aanpassing aan voedingsstress te bestuderen. Dit manuscript geeft een gedetailleerd overzicht van de χCRAC-methode en presenteert recente resultaten verkregen met de Nrd1 RBP.

Introduction

RNA’s vertrouwen vaak op RBP’s om hun functie uit te oefenen, wat heeft geleid tot grote interesse in het begrijpen van de dynamiek tussen deze moleculen. Veel RBP’s zijn geïdentificeerd in een grote verscheidenheid aan organismen. Het is echter altijd notoir moeilijk geweest om RBP-RNA-interacties in vivo te bestuderen. Een belangrijke doorbraak in het bestuderen van dergelijke interacties kwam met de opkomst van CLIP1. Deze methode maakt gebruik van ultraviolette (UV, 254 nm) bestraling om covalente bindingen tussen RBP’s en hun direct gebonden RNA’s (d.w.z. nul-afstand cross-linking) te induceren. Vervolgens wordt de relevante RBP onder strikte voorwaarden geimmunozuiverd om ervoor te zorgen dat alleen RNA’s die covalent aan de eiwitten zijn gekoppeld, worden geïdentificeerd. Gebonden RNA’s worden vervolgens gedeeltelijk verteerd met RNases en vervolgens omgezet in cDNA-bibliotheken voor sequencing. De hoge zuiveringsstrengheid is belangrijk omdat het de specificiteit van eiwit- en RNA-herstel aanzienlijk verhoogt, wat ook verder wordt verbeterd door SDS-PAGE-zuivering van het cross-linked ribonucleoproteïne (RNP) -complex. CLIP en aanverwante methoden geven ook inzicht in de nucleotideresolutie in de eiwitbindingsplaats, omdat tijdens de voorbereiding van de sequencingbibliotheek aminozuren die aan het RNA zijn gekoppeld vaak de reverse transcriptase beëindigen of ervoor zorgen dat het enzym mutaties op deze plaats introduceert 1,2,3.

Sinds de introductie heeft het oorspronkelijke CLIP-protocol een opmerkelijke verscheidenheid aan afgeleide methodologieën opgeleverd. Een bijzonder belangrijke doorbraak kwam met de ontwikkeling van HITS-CLIP (of CLIP-seq), die high-throughput sequencing combineert met de CLIP-benadering3. Dit is sindsdien overgenomen door alle CLIP-gebaseerde methodologieën. iCLIP introduceerde verbeteringen in de RNase-gemedieerde trim- en adapterligatietechnieken die een nauwkeurigere mapping van de RBP-bindingsplaatsen mogelijk maken4. PAR-CLIP combineerde 4thio-uridine/uracil labeling met cross-linking bij 365 nm, waardoor het mogelijk is om cross-linking sites in kaart te brengen door T-C substitutieste analyseren 5. CRAC, ureum-iCLIP, dCLIP en uvCLAP introduceerden denatureringscondities en dubbele affiniteitszuiveringsstappen die de achtergrondbinding aan de affiniteitshars verder verminderen en de specificiteit van eiwitvangst verder verhogen 2,6,7,8,9. Bovendien introduceerden CRAC, uvCLAP en dCLIP het taggen van de RBP van belang met een affiniteitstag, waardoor de noodzaak om specifieke antilichamen te genereren werd overwonnen.

Er zijn ook verschillende optimalisaties doorgevoerd om de CLIP-methodologie te versnellen. Het oorspronkelijke CLIP-protocol maakte gebruik van radiolabeling van de gevangen RNA’s om de RBP-RNA-complexen na SDS-PAGE te visualiseren. Het gebruik van radioactiviteit kan echter problematisch zijn voor laboratoria die niet voor dergelijk werk zijn opgezet. irCLIP bevat een fluorofoor-gekoppelde adapter die visualisatie vergemakkelijkt door middel van infraroodbeeldvorming10 en sCLIP maakt gebruik van biotinylering van gevangen RNA’s om ze te visualiseren via streptavidine-geconjugeerde HRP11. Bovendien ziet eCLIP volledig af van RNA-etikettering; in plaats daarvan wordt het eiwit weggesneden op basis van de bekende grootte12. Op Streptavidin gebaseerde zuivering is ook gebruikt om het proces van bibliotheekvoorbereiding in FAST-iCLIP te versnellen, waarbij een gebiotinyleerde 3′-adapter op de RNA’s wordt geligeerd en wordt gebruikt om zuivering mogelijk te maken na reverse transcriptie en circularisatie13. Extra verbeteringen aan het iCLIP-protocol hebben ook de complexiteit van de bibliotheken aanzienlijk verhoogd4.

Ten slotte is CLIP aangepast om het vastleggen van RBP’s uit verschillende cellulaire subcompartimenten 14,15 mogelijk te maken, om nieuw getranscribeerde RNA’s te visualiseren met behulp van gepulseerde inductie van fotoactiveerbare ribonucleosiden 5,16,17, om gemethyleerde RNA’s18,19,20 te vangen, om RNA-RNA-interacties 21,22 te onderzoeken en om 3′-uiteinden 23,24 in kaart te brengen .

Ondanks de grote bijdragen van CLIP-gebaseerde technieken bij het helpen begrijpen van de interacties tussen RBP’s en RNA’s, is het beperkt door de inefficiëntie van UV-crosslinking. Hoewel kweekcellen die in een monolaag worden gekweekt over het algemeen relatief gemakkelijk te verknopen zijn, is dit aanzienlijk uitdagender in weefsels of cellen in oplossing. Weefsels kunnen meerdere rondes van UV-blootstelling vereisen om door te dringen tot de vereiste cellagen, terwijl microbiële cellen vaak worden gekweekt in rijke media die aromatische, UV-absorberende verbindingen bevatten25. Uv-bestralingstijden tot 30 minuten zijn inderdaad gebruikt om voldoende cross-linking tussen RBP’s en hun gebonden RNA’s voor dergelijke monsters te genereren26,27,28. Deze uitgebreide UV-blootstelling induceert stressreacties in de cel, zoals UV-geïnduceerde DNA-schade, die de uiteindelijke gegevens in sommige toepassingen kan verontreinigen.

De meeste CLIP-studies hebben zich gericht op het genereren van enkele “snapshots” van specifieke eiwit-RNA-interacties in een cel. Eiwit-RNA-interacties zijn echter inherent dynamisch, vooral wanneer cellen onderhevig zijn aan veranderingen in hun omgeving. Dit kan een plotselinge vermindering van de beschikbaarheid van essentiële voedingsstoffen of snelle temperatuurveranderingen omvatten. Om de rol van een RBP tijdens stress echt te begrijpen, is het daarom het beste om tijd-opgeloste analyses uit te voeren, omdat ze het volledige spectrum van RBP-doelen tijdens stress kunnen vastleggen en kunnen bepalen in welk stadium van de stressrespons de gekozen RBP actief is. In het bijzonder toonden studies in gist aan dat de eerste paar minuten van aanpassing absoluut cruciaal zijn voor overleving en RNA-halfwaardetijden in bacteriën kunnen variëren van minuten tot seconden 29,30,31,32,33. Daarom moeten dergelijke tijd-opgeloste analyses idealiter worden uitgevoerd met een hoge temporele resolutie. De lange cross-linking tijden maken de studie van adaptieve reacties in een vroeg stadium echter bijzonder uitdagend.

Om deze problemen op te lossen, hebben we onlangs een verbeterde methode ontwikkeld die in staat is om cellen te koppelen en te oogsten op minutenlange tijdschalen. Onze χCRAC-methode maakt kwantitatieve meting van dynamische veranderingen in RBP-RNA-interacties met voorheen ongewilde resolutie mogelijk. Cruciaal voor deze methode was de ontwikkeling van een nieuw UV-bestralingsapparaat32 dat de vereiste cross-linking tijd in gist en bacteriën in oplossing ongeveer 10-voudig vermindert, waardoor RBP-RNA-interacties onmiddellijk effectief worden bevroren. Om de cellen na UV-bestraling snel te oogsten, hebben we bovendien een vacuümfiltratieapparaat ontwikkeld dat exponentieel groeiende gist kan oogsten in een 0,5 L-cultuur in ongeveer 30 s32. Deze technologische innovaties maken de studie van RBP-RNA-dynamica op minuutschaal mogelijk. Daarnaast hebben we ook verschillende optimalisaties geïntroduceerd in het oorspronkelijke CRAC-protocol2 om de bruikbaarheid ervan te vergroten.

Met behulp van χCRAC bestudeerden we onlangs het targetoom van een gistkern-RBP, Nab3, als reactie op glucosedeprivatie. In Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 een complex vormen met Nrd1, een RBP, en het RNA-helicase Sen1 om het NNS-complex te vormen. NNS-binding aan het RNA-polymerase en het ontluikende transcript kan transcriptionele beëindiging veroorzaken34. Dit complex is meestal betrokken bij het verwijderen van cryptische niet-coderende RNA-transcripten, maar er is ook aangetoond dat het de expressie van eiwitcoderende genen reguleert. De studie toonde differentiële targeting van Nab3 naar niet-coderende en coderende transcripten na slechts een minuut stress32. We toonden aan dat co-transcriptionele beëindiging door Nab3 resulteert in een zeer voorbijgaande, pulsachtige expressie van retrotransposongenen, die moeilijk te detecteren zou zijn geweest met behulp van traditionele CLIP-gebaseerde benaderingen. Bovendien verhoogden de korte UV-bestralingstijden in onze UV-cross-linker ook het herstel van kortlevende niet-coderende RNA’s32 aanzienlijk. χCRAC zal waarschijnlijk een cruciaal instrument zijn om niet alleen te verduidelijken hoe RBP’s de reactie op stress op onmiddellijke tijdschalen vormgeven, maar ook hun veranderende rollen gedurende de hele levenscyclus van een respons. Dit manuscript geeft een gedetailleerd overzicht van alle stappen in het χCRAC protocol. Ter illustratie werd de methode gebruikt om het gist Nrd1-eiwit te bestuderen, dat betrokken is bij transcriptionele beëindiging en RNA-verval35,36, en het RNA-targetoom als reactie op glucosedeprivatie over een groot aantal tijdpunten. Ten slotte tonen we ook aan dat onze UV-bestralingseenheid RBP’s snel kan koppelen aan RNA in HeLa-cellen, waardoor het mogelijk is om ook in adherente cellen tijd-opgeloste analyses met hoge resolutie uit te voeren.

Protocol

TN150 50 mM Tris pH 7,8 150 mM NaCl 0,1% NP-40 1X proteaseremmer TN1000 50 mM Tris pH 7,8 1M NaCl 0,1% NP-40 NP-PNK 50 mM Tris-HCl pH 7,8 10 mM MgCl2 0,1% NP-40 5 mM bèta-mercaptoethanol 5 x PNK 250 mM Tris-HCl pH 7,8 50 mM MgCl2 50 mM bèta-mercaptoethanol WB I 50 mM Tris-HCl pH 7,8 300 mM NaCl 10 mM imidazool 6M guanidine-HCl 0,1% NP-40 5 mM bèta-mercaptoethanol WB II 50 mM Tris-HCl pH 7,8 50 mM NaCl 10 mM imidazool 0,1% NP-40 5 mM bèta-mercaptoethanol Elution buffer 50 mM Tris pH 7,8 50 mM NaCl 250 mM imidazool 0,1% NP-40 5 mM bèta-mercaptoethanol Protease K buffer 50 mM Tris 0,1% NP-40 5 mM β-mercaptoethanol 1% SDS 5 mM EDTA 50 mM NaCl2 Lysisbuffer voor zoogdieren 50 mM Tris-HCl pH 8 100 mM NaCl 0,5% v/v Triton X-100 0,25% m/v Na-deoxycholaat 0,1% m/v SDS 5 mM EDTA 1 mM DTT (vers toegevoegd) 1X proteaseremmer Tabel 1: De buffers die nodig zijn voor χCRAC en hun samenstelling. 1. UV-cross-linking en lysaatproductie Micro-organismen in oplossingEnt 3,5 L van het gewenste medium met gist uit een nachtcultuur tot een start-OD600 van 0,05. Groei bij 30 °C met continu schudden bij 180 tpm. Bereid tijdens de groei andere benodigde materialen voor.Bereid een container met vloeibare stikstof voor. Bereid 3 L stressverwekkend medium en warm tot 30 °C in een waterbad. Stel het filterapparaat in, zet de cross-linker aan (figuur 2A) en label 50 ml conische buizen, één voor elk tijdspunt. Zodra de cellen de gewenste OD 600 hebben bereikt, giet u500 ml cellen rechtstreeks in de cross-linker en UV-bestraling met 250 mJ van 254 nm UV. Zie figuur 2A en figuur 3A voor meer informatie over het gebruik van de crosslinker.OPMERKING: De UV-stralingsenergie moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd voor elk eiwit van belang. Zie de discussie voor meer informatie. Na crosslinking filtert u de cellen met behulp van een van de vacuümfiltratieapparaten (figuur 2B, C). Rol het membraan op met de gefilterde cellen, plaats in de t = 0 (time zero) 50 ml conische buis en bevries in vloeibare stikstof. Filter de resterende cellen over zes verschillende filters. Resuspendie van de verzamelde cellen in de 3 L van eerder verwarmd stress-inducerend medium door de membranen in het medium te laten vallen en krachtig te mengen met een stripette gedurende 50 s. Bereid je na de 50 s voor op het nemen van het t = 1 monster. Crosslink na 1 minuut 500 ml cellen en oogst door filtratie zoals in stappen 1.1.3-1.1.4. Herhaal dit na 2, 4, 8, 14 en 20 minuten, of verschillende tijdpunten indien nodig. Bewaar de conische buizen met de cellen bij -80 °C. Stel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) een nacht in op 4 °C. Neem de volgende dag elke conische buis met een verknoopt monster en resuspensie de cellen in 25 ml koude PBS door krachtig te schudden. Breng de celsuspensies over naar nieuwe conische buizen en draai bij 4.600 x g, 5 min bij 4 °C. Giet de PBS eraf, draai snel opnieuw om resterende PBS te verzamelen en decanteer vervolgens de resterende vloeistof met een pipet. Bereken het gewicht van de pellet in de buis door deze te vergelijken met een lege buis. Voeg twee pelletvolumes ijskoud TN150, 60 μL DNase 1 en 10 μL RNaseremmer toe. Incubeer op ijs gedurende 30 min.Voeg bijvoorbeeld voor 400 mg cellen 800 μL ijskoud TN150 toe. De toevoeging van de DNase is niet essentieel voor de meeste oplosbare eiwitten, maar is erg belangrijk bij het bestuderen van chromatine-gebonden eiwitten zoals RNA-polymerase. Bovendien vermindert het de viscositeit van bacteriële lysaten. Het is erg belangrijk om precies twee pelletvolumes van de lysisbuffer te gebruiken, anders kan de lysis-efficiëntie afnemen. Voeg drie pelletvolumes (in ml) zirkoniaparels toe aan de celsuspensie. Gebruik voor gist kralen met een diameter van 0,5 mm en gebruik voor bacteriën 0,1 mm.Meet bijvoorbeeld voor 400 mg cellen 1,2 ml zirkoniaparels in een buis van 1,5 ml en voeg ze toe aan de cellen die in lysisbuffer zijn geresuspendeerd. Draai de cel suspensies gedurende 1 minuut, plaats vervolgens op ijs gedurende 1 min. Herhaal dit in totaal 5x. Voeg twee pelletvolumes TN150-buffer en vortex krachtig toe om te mengen. Centrifugeer de suspensie in de conische buis bij 4.600 g gedurende 20 minuten bij 4 °C in een tafelcentrifuge.Neem na het centrifugeren een monster van 50 μL van het supernatant voor toekomstige Western blot-analyse om de expressie van het hele celeiwit te onderzoeken. Breng de supernatanten over in buisjes van 1,5 ml en draai het lysaat gedurende 20 minuten bij 20.000 x g bij 4 °C, in een microfuge.Als alternatief, als u buizen van 5 ml gebruikt, centrifugeer dan gedurende 20 minuten op 13.000 x g . Neem na centrifugatie een monster van 50 μL van het supernatant voor toekomstige Western blot-analyse om de oplosbare expressie van het eiwit te onderzoeken. Ga verder met RBP-vastlegging (sectie 2). Gekweekte adherente cellenZaai voldoende hechtende cellen in een petrischaaltje 24 uur voorafgaand aan UV-crosslinking, zodat ze de volgende dag 80% confluentie kunnen bereiken. Kweek ‘s nachts in het gewenste medium in een celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2.OPMERKING: Bij gebruik van kwarts petrischalen is het gunstig om de celhechting te bevorderen door de behandeling van de cultuurware met poly-D-lysine (70.000-140.000 wt) en foetaal kalfsserum (FCS) 2,5 uur voor het zaaien. Voeg voldoende poly-D-lysine toe om het hele groeioppervlak te bedekken en incuber gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Vervolgens moet de kwarts petrischaal grondig worden gespoeld met water en gedroogd in de celkweekincubator gedurende 2 uur of totdat deze volledig droog is. Voeg daarna voldoende FCS toe om het groeioppervlak volledig te bedekken en plaats het minstens 30 minuten in de incubator. De FCS moet volledig worden verwijderd voordat cellen worden gezaaid. Zodra de cellen 80% confluentie hebben bereikt, verwijdert u de media en wast u met 15 ml ijskoude PBS. Verwijder vervolgens alle resterende vloeistof volledig en ga onmiddellijk verder met de volgende stap. Breng de petrischaal over in de lade voor aanhechtende cellen (figuur 3B) en UV-bestraling met 300 mJ van 254 nm UV. Zie figuur 2A en figuur 3B voor meer informatie over het gebruik van de crosslinker.OPMERKING: De UV-stralingsenergie moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd voor elk eiwit van belang. Zie de discussie voor meer informatie. Plaats direct na het crosslinken de petrischaal op ijs en voeg 10 ml ijskoude PBS toe. Verzamel cellen door te schrapen en over te brengen naar een conische buis van 15 ml. Pellet door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder de PBS en resuspendeerde de celpellet in 1 ml ijskoude PBS en breng over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pelletcellen opnieuw door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Verwijder de PBS en vries de celkorrels in op droogijs. Bewaar de celpellets bij -80 °C totdat ze nodig zijn. Herhaal stap 1.2.3–1.2.6 voor elk tijdspunt. Resuspendeer de celpellets in 1 ml lysisbuffer en breng ze over in een conische buis van 15 ml. Voeg daarna 1 ml lysisbuffer toe voor een totaal van 2 ml. Voeg 5 μL RNaseremmer voor zoogdieren toe. Sonicate 5x voor 10 s op ijs op 10 ampère. Wacht 30 s tussen ultrasoonapparaatrondes. Bereken de eiwitconcentratie van elk monster en normaliseer tot de laagste concentratie. Breng 1,98 ml lysaat over in een buis van 2 ml. Voeg 10 μL DNase I toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C met schudden bij 1.200 tpm. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.Neem na centrifugatie een monster van 50 μL van het supernatant voor toekomstige Western blot-analyse om de oplosbare expressie van het eiwit te onderzoeken. Ga verder met RBP-vastlegging (sectie 2). 2. RBP-vastlegging Was de magnetische anti-FLAG (75 μL slurry per monster) of IgG agarose (500 μL slurry per monster) kralen 3x met 5 ml TN150. Resuspendeer in een eindvolume van 700 μL TN150 en voeg 100 μL gewassen kralen toe aan zeven conische buisjes van 15 ml.Bewaar op ijs totdat het nodig is. Zodra de lysaten zijn geklaard, voegt u het supernatant toe aan de buis met de anti-FLAG/IgG-kralen. Nutate bij 4 °C gedurende 2 uur.OPMERKING: Sommige protocollen beschrijven nachtelijke incubaties met de kralen, maar dit wordt niet aanbevolen, omdat lange incubatietijden het herstel van verknoopte RNA’s drastisch kunnen verminderen. 3. Het wassen van de kralen en TEV-decolleté van de tags Oogst de kralen en verwijder het lysaat.Neem een monster van 50 μL van het supernatant voor toekomstige Western blot-analyse om het niet-gevangen eiwit te onderzoeken. Resuspensie van de kralen in ijskoud TN1000 en breng over in een buis van 1,5 ml. Wassen gedurende 10 min, 4 °C, met nutatie. Herhaal dit voor een totaal van drie wasbeurten.Als u IgG agarose kralen gebruikt, was dan met 5 ml TN1000. Als u anti-FLAG-kralen gebruikt, gebruik dan 2 ml. Was vervolgens de kralen 3x met TN150, met hetzelfde volume als hierboven. Na de derde wasbeurt, resuspensie de kralen in 600 μL TN150. Voeg 30 U zelfgemaakte GST-TEV protease toe aan de kraalsuspensie en draai gedurende 2 uur bij RT.OPMERKING: Recombinant GST-TEV protease is nu ook in de handel verkrijgbaar, maar het is niet getest met dit protocol.Bereid je tijdens de vertering voor op de volgende stappen door kolommen van drie buisjes van 1,5 ml voor elk monster op te zetten (d.w.z. voor zeven monsters, drie rijen van zeven kolommen hebben). Voeg aan de laatste rij buizen 0,4 g guanidiumhydrochloride, 27 μL 5M natriumchloride en 3 μL 2,5 M imidazool (pH = 8) toe. Merk op dat de pH van de imidazool 8 moet zijn. Dit is van cruciaal belang om de RNA-integriteit te behouden. Was daarnaast het benodigde volume nikkelkralen in WB I 3x. Gebruik 100 μL drijfmest per monster. Na de laatste wasbeurt, resuspensie de kralen in hetzelfde oorspronkelijke volume van WB I en bewaar op ijs. Zodra de TEV-vertering is voltooid, verzamelt u het supernatant met behulp van een magnetisch rek voor anti-FLAG-kralen of centrifugatie voor IgG-kralen en brengt u het over naar de eerste rij van de eerder ingestelde buizen.Neem een monster van 50 μL van het TEV-eluaat voor Western blot-analyse. Stel een thermoblokincubator in op 37 °C. Voeg aan de tweede rij buisjes 1 μL RNase-cocktail (1:50 verdunning) toe. Neem 550 μL TEV eluate uit de eerste rij buizen en voeg toe aan de tweede rij (met de RNase-cocktail). Pipetteer krachtig om menging te garanderen. Nadat u dit voor het eerste monster hebt voltooid, plaatst u de buis onmiddellijk in het thermoblok en start u een timer. Ga verder met de volgende monsters, zodat ze allemaal gespreid zijn. Incubeer precies 5 min. Eenmaal voltooid, verwijdert u het eerste monster uit het thermoblok en brengt u de oplossing over naar de derde rij buizen (die het guanidiumhydrochloridepoeder bevat).OPMERKING: Een incubatie van 5 minuten met een verdunning van 1:50 van de RNase-cocktail is meestal geschikt voor de meeste eiwitten, maar deze stap moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd met verschillende incubatietijden of concentraties voor elk eiwit om ervoor te zorgen dat de verknoopte RNA’s de juiste grootte hebben (30-100 nt). Draai onmiddellijk een paar seconden op volle snelheid om het guanidiumpoeder op te lossen en ga dan verder met het volgende monster. Nadat alle monsters in het guanidiumpoeder zijn overgebracht, vortex opnieuw om ervoor te zorgen dat al het poeder volledig is opgelost. Voeg 100 μL gewassen nikkelparels toe en draai een nacht bij 4 °C. Deze incubatie kan worden verkort tot 2 uur. 4. Behandeling met alkalische fosfatase op de kraal Stel een thermoblok in op 37 °C. Plaats een zuiveringsspinkolom in een buis van 2 ml, één voor elk monster. Breng de nikkelparels over op de kolommen en laat het supernatant doorlopen. Zorg er daarna voor dat alle nikkelparels uit de buis van 1,5 ml zijn verwijderd door af te spoelen met WB I en op de kolom aan te brengen. Zet 2 ml buisjes op, zes per monster (één om elke wasbeurt te verzamelen). Houd de buitenkant van de kolommen droog om de stroming te behouden. Was de kralen 3x met 500 μL WB I en daarna 3x met 500 μL NP-PNK. Sluit het deksel van de spinkolom en draai kort kralen om overtollige buffer te verwijderen. Plaats de stop op de kolom, plaats kolommen in buisjes van 1,5 ml en voeg 60 μl van het reactiemengsel in tabel 2 toe. Bestanddeel 1x 7,5x 5 x PNK-buffer 12 90 Alkalische fosfatase 4 30 RNaseremmer 2 15 H2O 42 315 Einddeel 60 μL 450 μL Tabel 2: Alkalisch fosfatasereactiemengsel. Incubeer de kralen gedurende 1 uur bij 37 °C. Was de kralen 1x met 500 μL WB I om de alkalische fosfatase te inactiveren en vervolgens 3x met 500 μL NP-PNK buffer. Zorg ervoor dat u de binnenkant van de kolom grondig spoelt met de NP-PNK-buffer om eventuele sporen van guanidium te verwijderen. 5. On-bead ligatie van de App-PE linker naar het 3′ uiteinde van het RNA Spin de resterende buffer uit en voeg 60 μL van het in tabel 3 gespecificeerde mengsel (zie tabel 4 voor de App-PE-sequentie) toe aan de kolommen. Incubeer de reactie gedurende 6 uur bij 25 °C. Bestanddeel 1x 7,5x 5 x PNK-buffer 12 90 App-PE-adapter (100 μM) 0.6 4.5 T4 RNA ligase 2 afgeknotte K227Q 3 22.5 RNaseremmer 1.5 11.25 50% PEG 8000 12 90 H2O 30.9 231.75 Einddeel 60 μL 450 μL Tabel 3: App-PE linker ligatiereactiemengsel. Oligonucleotide naam Volgorde (5′-3′) L5Aa invddT-ACACrGrArCrUrCrUrUrCrCrCrArUrCrNrNrNrUrArArGrCrN-OH L5Ab invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrUrArGrCrN-OH L5Ac invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrArUrCrNrNrNrGrCrArGrCrN-OH L5Ad invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrCrArUrCrNrCrGrCrUrUrArGrCrN-OH L5Ba invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrArUrCrCrNrNrArGrArGrCrN-OH L5Bb invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrCrNrNrNrGrUrGrArGrCrCrN-OH L5Bc invddT-ACACrGrArCrCrCrCrUrCrCrCrCrArCrUrCrNrCrArCrUrArGrCrN-OH L5Bd invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrGrArUrCrNrNrNrUrCrUrCrUrArGrCrN-OH L5ca invddT-ACACrGrArCrUrCrUrUrCrCrCrCrArUrCrNrNrNrCrUrArGrCrN-OH L5Cb invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrGrArGrCrN-OH L5cc invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrCrArUrCrCrNrArCrUrCrArGrCrN-OH L5Cd invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrGrArUrCrCrNrNrNrGrArCrUrUrArGrCrN-OH L5Da invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrArUrCrNrNrCrGrUrGrArUrN-OH L5Db invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrCrArCrUrNrNrNrGrCrArCrUrArN-OH L5Dc invddT-ACACrGrArCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArGrUrGrGrCrN-OH L5Dd invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrCrArCrUrCrNrNrNrArUrCrArCrGrN-OH L5Ea invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrGrUrN-OH L5Eb invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrArUrCrNrNrGrUrGrArCrArN-OH L5Ec invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrArUrCrNrUrGrUrCrArCrN-OH L5Ed invddT-ACACrGrArCrCrCrUrCrUrUrCrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrArGrUrGrN-OH App_PE App-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC Tabel 4: De sequenties van de DNA- en RNA-adapters die nodig zijn voor ligatie op de 5′ en 3′ uiteinden van gevangen RNA’s. Deze werden gezuiverd door middel van RNase-vrije HPLC. Was kralen 1x met 500 μL WB I en 3x met 500 μL NP-PNK buffer. Doe de kolom in een nieuwe buis en draai de resterende buffer eruit. 6. Fosforylering van de 5′ uiteinden van het RNA op de kraal Voeg 80 μL van het in tabel 5 vermelde mengsel toe aan de kolommen. Incubeer de reactie gedurende 40 minuten bij 37 °C.OPMERKING: De monsters zullen nu zeer radioactief zijn. Daarom moeten alle daaropvolgende werkzaamheden achter een beschermend scherm worden uitgevoerd en moet afval worden verwijderd volgens de lokale gezondheids- en veiligheidsvoorschriften. Bestanddeel 1x 7,5x 5 x PNK-buffer 16 120 32P-ɣATP (10 μCi/μL) 3 22.5 T4 PNK 3 22.5 H2O 58 435 Einddeel 80 μL 600 μL Tabel 5: Fosforyleringsreactiemengsel. Voeg 1 μL 100 mM ATP toe en laat de reactie nog eens 20 minuten duren. Dit zorgt ervoor dat bijna alle 5′-uiteinden fosfaten hebben om ligatie van de 5′-linker te vergemakkelijken. Zet 2 ml buisjes op, vijf per monster. Was kralen 1x met 500 μL WB I en 3x met 500 μL NP-PNK buffer. Merk op dat deze eluties zeer radioactief zullen zijn en daarom op de juiste manier moeten worden verwijderd. Verplaats de kolom naar de laatste buis en draai de resterende buffer uit. 7. On-bead ligatie van de 5′ linker OPMERKING: De 5′-linkers bevatten een RNA-streepjescode die wordt gebruikt voor de identificatie van elk monster na sequencing. Het is dus absoluut cruciaal om op te merken welke linker voor welk monster wordt gebruikt. Voeg 78 μL van het in tabel 6 beschreven mengsel toe aan de kolommen. Voeg 2 μL 5’ adapter (100 μM; zie tabel 4) toe aan elke buis en incubeer ‘s nachts bij 18 °C. Bestanddeel 1x 7,5x 5 x PNK-buffer 16 120 ATP (10 mM) 8 60 RNaseremmer 2 15 T4 RNA ligase 4 30 H2O 48 360 Einddeel 78 μL 585 μL Tabel 6: 5’ linkerligatiereactiemengsel. Was de kralen de volgende dag 1x met 500 μL WB I en 3x met 500 μL WB II en breng de kolommen over in een nieuwe buis van 2 ml. 8. Elutie, SDS-PAGE en RNA-extractie Stel de centrifuge in op 4 °C. Bereid twee rijen buisjes van 1,5 ml per monster voor op elutie. Spin het lege volume van de kolommen met nikkelkralen uit met een snelle draai. Plaats de kolommen in de eerste rij elutiebuizen en voeg 200 μL elutiebuffer toe. Wacht 2 minuten en forceer de buffer vervolgens met een snelle draai door de kolom. Verplaats de kolommen naar de tweede rij buizen en herhaal stap 8.2. Elk monster heeft nu in totaal 400 μL eluaat, verdeeld over twee buizen van 1,5 ml.Neem alle eluaten en breng ze samen over in een buis van 5 ml. Voeg 2 μL van 20 mg/ml glycogeen toe. Dus, als zeven monsters worden gebruikt, zal er nu 2,8 ml gepoold eluaat in de buis van 5 ml zitten. Voeg 100 μL trichloorazijnzuur (TCA) per monster [bijv. 700 μL TCA voor 7 monsters (2,8 ml samengevoegd eluaat)] toe aan de buis van 5 ml en vortex goed gedurende 30 s. Incubeer op ijs gedurende 20 min. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 17.000 x g, 4 °C, in een tafelcentrifuge. Verwijder het supernatant voorzichtig uit de conische buis en controleer de pipet met een geigerteller om er zeker van te zijn dat de pellet niet per ongeluk is verwijderd. Als dit het geval is, brengt u het supernatant terug naar de buis en centrifugeert u nog eens 10 minuten.OPMERKING: Het supernatant kan nog steeds zeer radioactief zijn. Zorg ervoor dat u de juiste afscherming gebruikt. Resuspendeer de pellet volledig in 2 ml ijskoude aceton. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 17.000 x g, 4 °C. Verwijder zoveel mogelijk van de aceton met een P1000 pipet. Draai daarna kort aan de buis om kleine druppeltjes aceton te verzamelen en verwijder deze vervolgens met een P10-pipet. Droog gedurende 2 minuten in een zuurkast.OPMERKING: Het acetonsupernatant kan nog steeds radioactief zijn. Zorg ervoor dat u de juiste afscherming gebruikt. Suspensie van het monster in 30 μL van 1x eiwitbelastingsbuffer. Om ervoor te zorgen dat de pellet goed wordt geresuspendeerd, controleert u of het overgrote deel van de radioactiviteit nu aanwezig is in de laadbuffer en niet in de buis van 1,5 ml is achtergebleven door de oplossing in een P200-pipet te verwijderen en de activiteit in de buis van 1,5 ml te meten met behulp van een geigerteller. Verwarm het monster gedurende 10 minuten bij 65 °C. Belasting op een 1 mm, 4-12% prefab Bis-Tris gel en laat 1,5 uur draaien bij 125 V in MOPS-buffer. Nadat de gel klaar is met lopen, opent u de gelcassette. De gel moet op de bodemplaat worden bewaard. Gooi de bovenkant weg. Wikkel de gel in vershoudfolie en bevestig deze vervolgens met tape aan de binnenkant van een lichtdichte cassette. Zorg ervoor dat de cassette een versterkend scherm heeft om het signaal te verbeteren. Stel een autoradiografische film bloot aan de gel en bewaar de cassette bij -80 °C tijdens de belichting. De blootstellingstijd zal variëren tussen eiwitten met verschillende cross-linking efficiënties.Bij het plaatsen van de film moet er een manier zijn om deze opnieuw uit te lijnen op de cassette om de band van belang in de volgende stap uit te snijden. Om dit te garanderen, gebruikt u een fluorescerende liniaal en zorgt u er ook voor dat de gel zich in een hoek van de cassette bevindt, die vervolgens wordt bedekt door de film die ook in de uiterste hoek is geplaatst.OPMERKING: Als vuistregel geldt dat eluates in de laadbuffer die een aflezing van ten minste ~ 250 cps geven wanneer ze worden weergegeven aan een geigerteller voldoende signaal geven voor een blootstelling van 3 uur. Anders wordt ‘s nachts blootstelling uitgevoerd. Ontwikkel de film. Knip de vershoudfolie weg die de gel bedekt, maar beweeg de gel niet. Anders wordt de afbeelding verschoven van de gel.OPMERKING: De gel zal waarschijnlijk zeer radioactief zijn. Zorg ervoor dat u de juiste afscherming gebruikt bij het uitsnijden van de gelschijf. Plaats de film over de gel en snijd de band van belang weg. Doe de plak gel in een tube van 2 ml. Sla de plak gel kapot met een P1000-pipetpunt en voeg 600 μL proteïnase K-buffer plus 200 μg proteïnase K toe (dit protocol gebruikt 10 μL van een 20 mg / ml proteïnase K-oplossing). Incubeer gedurende 2 uur bij 55 °C met krachtig schudden. Snijd daarna het uiteinde van een P1000-punt af met een schoon scalpel en breng het supernatant en de gelstukjes over naar een spinkolom die in een buis van 2 ml is geplaatst. Draai de kolom gedurende 1 minuut op 17.000 x g bij RT. Verzamel de doorstroming, die de radioactieve, geïsoleerde RNA’s bevat. Voer een fenol: chloroform-extractie uit.Voeg 50 μL 3 M natriumacetaat, pH = 5,2 en 500 μL fenol: chloroform en vortex goed toe. Draai gedurende 5 minuten op 17.000 x g. Verwijder de waterige toplaag en plaats deze in een nieuwe buis van 1,5 ml. Voeg 500 μL chloroform en vortex krachtig toe gedurende 10-15 s. Draai gedurende 5 minuten op 17.000 x g bij RT. Verwijder de waterige laag en plaats in een nieuwe buis van 1,5 ml. Voeg 1 μL 20 mg/ml glycogeen en 1 ml ijskoud, 96% ethanol toe. Neerslag gedurende 30 min bij -80 °C of ‘s nachts bij -20 °C. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 4 °C, 17.000 x g. Verwijder het supernatant, voeg 500 μL 70% ethanol toe en centrifugeer gedurende 5 min, 4 °C bij 17.000 x g. Verwijder alle ethanol, voer een snelle spin uit om residu te verzamelen en verwijder overtollig afval met een P10-pipet. Droog de pellet gedurende ~3 min in een zuurkast. Resuspendie in 20 μL DEPC-behandeld water. Bewaar het RNA ‘s nachts bij -80 °C of ga onmiddellijk verder met de omgekeerde transcriptiestap. 9. Omgekeerde transcriptie Voeg 2 μL 10 μM RT oligo (PE_reverse; zie tabel 7) en 4 μL 5 mM dNTP’s toe aan de 20 μL RNA. Oligonucleotide naam Volgorde (5′-3’) P5 vooruit AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTCTCTCCCTACACGACGCTCTCTTCCGATCT BC1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT BC3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT BC4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT BC5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT BC7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT BC8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT BC9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT BC10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT PE_reverse CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Tabel 7: De PCR primers (inclusief de barcode sequenties) en de reverse transcriptie primer. Breng over in een voorverwarmd thermoblok bij 85 °C gedurende 3 minuten en klik vervolgens 5 minuten op ijs. Verzamel de inhoud van de buis door korte centrifugatie en voeg vervolgens 8 μL 5x reverse transcriptasebuffer, 2 μL 100 mM DTT en 2 μL RNaseremmer toe. Incubeer het mengsel bij 50 °C gedurende 3 minuten en voeg vervolgens 2 μl reverse transcriptase toe en incubeer gedurende 1 uur bij 50 °C. Inactiveer de reverse transcriptase door incubatie bij 65 °C gedurende 15 min. Breng de buizen over in een voorverwarmd thermoblok bij 37 °C en laat 3 minuten acclimatiseren. Voeg 2 μL RNase H toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Isoleer het cDNA met behulp van SPRI-kralen.Voeg twee volumes van 84 μL kralen toe. Incubeer gedurende 15 min. Leg de kralen op een magnetisch rek en laat 1 minuut staan om de kralen te oogsten. Verwijder en gooi het supernatant weg en voeg 200 μL 70% ethanol toe. Verwijder de kralen niet uit het magnetische rek. Incubeer de kralen met de ethanol gedurende 30 s. Verwijder de ethanol en herhaal de wasstap. Verwijder alle resterende ethanol met behulp van een P10-tip. Doe de kralen 2 minuten in een zuurkast om ze te drogen. Haal de kralen uit het rek, resuspensie in 12 μL water en leg de kralen terug op het rek. Verwijder 11 μL supernatant. Bevries het cDNA bij -20 °C of ga onmiddellijk verder met de PCR-stap. 10. qPCR reactie Voorafgaand aan de uiteindelijke PCR voor amplificatie van de cDNA’s wordt een kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) uitgevoerd om het optimale aantal cycli voor het versterken van de cDNA’s te identificeren om overamplificatie van de bibliotheek te voorkomen. Stel een qPCR-reactie in op ijs volgens tabel 8. Zie tabel 7 voor alle primers. Bestanddeel 1x 2x qPCR reactie mastermix 5 0,1 μM P5 primer (voorwaarts) 0.8 0,1 μM BC primer (omgekeerd) 0.8 cDNA (of water als negatieve controle) 1 H2O 2.4 Einddeel 10 μL Tabel 8: qPCR reactiemengsel. Voor een goede kwantificering van de cycli die nodig zijn voor amplificatie, gebruikt u drie technische replicaties voor het cDNA en drie negatieve (d.w.z. water) controles. Sluit de platen af met optisch transparante folie en voer de qPCR uit volgens de instructies van de kitfabrikant. Analyseer de monsters door middel van een absolute kwantificeringsmethode om het aantal cycli (n) te identificeren waarbij de knie van exponentiële groei wordt bereikt (zie figuur 4C voor een voorbeeld). Dit aantal cycli wordt vervolgens gebruikt voor de uiteindelijke versterking van de rest van het cDNA. 11. PCR-reactie en gelextractie Stel de PCR-reactie op ijs in volgens tabel 9. Zie tabel 7 voor alle primers.OPMERKING: Er wordt slechts 5 μL van de cDNA-bibliotheek gebruikt. Bestanddeel 1x 10 x proof-reading polymerase buffer 5 10 μM P5 primer (vooruit) 1 10 μM BC primer (omgekeerd) 1 5 mM dNTP’s 2.5 Proeflezen polymerase-enzym 1 cDNA 5 H2O 34.5 Einddeel 50 μL Tabel 9: PCR-reactiemengsel. Voer PCR als volgt uit: 95 °C gedurende 2 minuten; n cycli van 98 °C gedurende 20 s, 52 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 1 min; en 72 °C gedurende 5 min. Het aantal (n) cycli voor het versterken van de χCRAC-bibliotheek wordt bepaald door de qPCR beschreven in sectie 10. Voeg 1 μL exonuclease I toe en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C. Reinig het versterkte cDNA met behulp van SPRI-kralen zoals hierboven beschreven met behulp van twee volumes kralen (d.w.z. 100 μL). Elute in 11 μL. Voeg 3 μL 6x laadkleurstof toe en laat 1 uur in 1x TBE-buffer lopen op een prefab 6% TBE-gel bij 100 V. Gebruik een ladder die geschikt is voor het kwantificeren van korte DNA-fragmenten. Als u klaar bent, verwijdert u de gel uit de cassette en plaatst u deze in een geschikte, vloeistofdichte container met voldoende 1x TBE om de gel te bedekken (bijv. ~ 50 ml). Voeg een geschikte hoeveelheid SYBR-veilige kleurstof toe (gebruik bijvoorbeeld voor 50 ml 5 μl van een kleurstof van 10.000x) Laat de gel vlekken door zachtjes mengen gedurende 15 minuten bij RT. Giet de SYBR-bevattende 1x TBE af en vervang deze door schone 1x TBE. Was de gel gedurende 10 minuten met zacht schudden bij RT. Giet de 1x TBE af en leg de gel in een doorzichtige map. Knip de map op de juiste grootte. Beeld de gel af via een geschikt middel zoals een fosforimager. Snijd DNA-fragmenten tussen ~175 bp en ~400 bp. Doe de plak gel in een tube van 1,5 ml. Breek de plak gel grondig met een P1000-punt en voeg 400 μL H2O. Incubeer bij 37 °C met schudden gedurende 1 uur in een thermoblok. Vries het monster gedurende 10 minuten in op droogijs en plaats het vervolgens terug in het thermoblok bij 37 °C met schudden gedurende 1 uur. Maak een filtereenheid door een filterkolom te nemen en er twee glazen microvezelfilters in te plaatsen. Plaats het apparaat in een buis van 1,5 ml. Knip het uiteinde van een P1000-punt af met een schoon scalpel en neem de gebroken TBE-gelsuspensie op en doseer vervolgens in de filtereenheid die in stap 11.12 is gemaakt. Draai op 17.000 x g gedurende 30 s. Voeg 1 μL glycogeen toe aan het supernatant, samen met 40 μL natriumacetaat, pH = 5,2 en 1 ml 96% ethanol. Incubeer bij -80 °C gedurende 30 min. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 17.000 x g, 4 °C. Gooi het supernatant weg en was met 500 μL 70% ethanol. Draai gedurende 5 minuten, verwijder de ethanol volledig en droog de pellet vervolgens gedurende 3 minuten in een zuurkast. Resuspendie in 10 μL H2O en meet de DNA-concentratie.

Representative Results

Om de werkzaamheid van de χCRAC-methode aan te tonen, werd een tijdsloopexperiment uitgevoerd met giststammen die een HTP-gelabeld Nrd1-eiwit tot expressie brengen. Een gedetailleerde schematische weergave die beschrijft hoe de methode werkt, wordt gegeven in figuur 1. Net als Nab3 is Nrd1 betrokken bij nucleair RNA-verval van een verscheidenheid aan RNA-transcripten37. Eerder werk van het Corden-lab suggereerde dat Nrd1-binding aan zijn RNA-doelen aanzienlijk verandert wanneer cellen worden blootgesteld aan glucose-uithongering28,38. Als zodanig werden cellen die exponentieel groeiden in medium dat glucose (SD-TRP) bevat, gedurende een tijdsverloop naar hetzelfde medium zonder glucose (S-TRP) verschoven om dynamische veranderingen in Nrd1-RNA-interacties te volgen. Monsters werden genomen en verknoopt in de Vari-X-linkerkamer (figuur 3A) vóór de dienst en vervolgens na 1, 2, 4, 8, 14 en 20 minuten. Het medium dat werd gebruikt voor celgroei had opzettelijk een tekort aan tryptofaan om de UV-absorptie door dit aromatische aminozuur te verminderen. Merk op dat het het beste is om synthetisch medium te gebruiken dat gefilterd is, omdat autoclaveren van het medium kan leiden tot karamelisatie van de suikers. Dit vermindert vervolgens de cross-linking efficiëntie. Figuur 4A toont een representatieve autoradiograaf van een χCRAC-experiment. In dit voorbeeld zijn de monsters niet samengevoegd. In plaats daarvan werd elk afzonderlijk op de gel uitgevoerd. Dit wordt aanbevolen voor initiële experimentele tests om aan te tonen dat het eiwit effectief cross-linkt naar RNA op alle geteste tijdstippen. Een bijzonder intens signaal werd waargenomen bij het verwachte molecuulgewicht van de RBP, dat het eiwit vertegenwoordigt dat gebonden is aan zeer korte, radioactief gelabelde RNA’s die niet vatbaar zijn voor sequencing. Daarom werd het uitstrijksignaal boven deze band, het eiwit dat is verknoopt met langere RNA-fragmenten, geïsoleerd. Het fragment werd gesneden van net boven de eiwitband plus ongeveer 30 kDa. Figuur 4B toont een autoradiogram na excisie, waarbij het eiwit verknoopt is met korte RNA’s die in de gel zijn achtergebleven en het voorheen uitstrijksignaal nu is weggesneden. Na reverse transcriptie moet de cDNA-bibliotheek worden versterkt met behulp van PCR. Overamplificatie van de bibliotheek moet echter worden vermeden, omdat dit vertekening kan introduceren ten opzichte van sequenties die bij voorkeur door het polymerase worden versterkt en PCR-artefacten genereren. Overversterkte bibliotheken bevatten ook een groot aantal dubbele sequenties die afval leest op de sequencer. Om het ideale aantal PCR-cycli voor amplificatie van de uiteindelijke bibliotheek te berekenen, werd een aliquot van het cDNA versterkt door qPCR met behulp van de P5- en BC-oligonucleotiden. De eerste cyclus waarbij de bibliotheek piekfluorescentie bereikte, werd gekozen als de PCR-cyclustelling. Figuur 4C geeft een voorbeeld van een qPCR uit een typische cDNA-bibliotheek, die een piekcyclustelling van 16 opleverde. Deze waarde werd vervolgens gebruikt voor de uiteindelijke χCRAC PCR. Om de gesequentieerde gegevens te verwerken, gebruikten we software die eerder in ons lab was ontwikkeld (pyCRAC) en de bijbehorende pijplijn voor analyse van de kinetische CRAC-gegevens (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Deze open source softwaretools maken het mogelijk om de gegevens te demultiplexen en bij te snijden, PCR-duplicaten te verwijderen, statistisch significante pieken te identificeren, clusterinlezingen in aaneengesloten sequenties en bindingsmotieven te identificeren39. Meer informatie over hoe deze tools werken, is te vinden op hun respectieve webpagina’s. We zijn ook begonnen met het ontwikkelen van een χCRAC-protocol voor zoogdiercellen. De meeste cellijnen van zoogdieren worden gekweekt als een monolaag en het bakje in onze crosslinker met de UV-doorlatende zak is niet geschikt voor experimenten met aanhangende cellen. Om dit probleem op te lossen, hebben we een fase ontwikkeld waarin gebruikers 1-2 petrischalen (150 mm diameter en 25 mm diep) kunnen UV-bestralen met aanhangende cellen (figuur 3B). Als eerste test werd de efficiëntie van de cross-linker voor zoogdiercellen gemeten door cross-linking en capture van stabiel gelabelde GFP-RBM7 met behulp van anti-GFP-antilichamen en een traditionele CLIP-gebaseerde zuivering. Zoals te zien is in figuur 5A, was de cross-linker in staat om eiwit-RNA-complexen te herstellen uit zoogdiercellen die als een monolaag werden gekweekt met behulp van 254 nm UV-bestraling met efficiënties die vergelijkbaar zijn met een veelgebruikt UV-bestralingsapparaat. Standaard celkweek plasticware die normaal gesproken wordt gebruikt voor UV-crosslinkingexperimenten is echter ondoordringbaar tot 254 nm UV. Daarom zouden de cellen in onze cross-linker alleen bestraling ontvangen van de bovenste bank van UV-lampen. Om dit te ondervangen, ontwikkelden we een UV-doorlatende kwarts petrischaal voor celgroei en cross-linking. Het gebruik van de kwartscultuurware toonde een robuust herstel van eiwit-RNA-complexen met slechts 2 s UV-bestraling (figuur 5B). In combinatie met RBP-opnamemethoden voor zoogdiercellen zoals CLIP-technologieën, zijn deze korte crosslinkingtijden vatbaar voor tijdscursussen om spatiotemporale RNA-bindingsprofielen van RBP’s te herstellen als reactie op genotoxische spanningen of snelle uitputting van eiwitfactoren, of parallel met transcriptionele of celcyclussynchronisatie. Figuur 6 toont verschillende voorbeelden van de Nrd1-gegevens die door de χCRAC-pijplijn worden verwerkt. Dit cijfer is opgesteld met behulp van de bedgraph-bestanden die zijn gegenereerd door de pijplijn en het python GenomeBrowser-pakket (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), dat we hebben ontworpen om het maken van genoombrowserafbeeldingen van publicatiekwaliteit van de gegevens te vereenvoudigen. De grijze rechthoeken vertegenwoordigen genomische gebieden die niet-coderende RNA’s tot expressie brachten, zoals de cryptische onstabiele transcriptie (CUTs), stabiele niet-gekarakteriseerde transcripten (SUTs)40 en Xrn1-gevoelige onstabiele transcripten (XUTs)41. De gegevens in figuur 6 laten zien dat Nrd1 bindt aan veel van deze niet-coderende RNA-transcripten, in overeenstemming met het idee dat dit eiwit betrokken is bij de afbraak van deze klasse transcripten42. Figuur 6A toont een ~15 kb gebied op chromosoom IV. Hier was er een significante toename in de binding van Nrd1 aan transcripties die coderen voor de glucosetransporters HXT6 en HXT7 met hoge affiniteit, die beide worden geupreguleerd tijdens glucose-uithongering. Het is waarschijnlijk dat transcriptiebeëindiging door het NNS-complex de inductiekinetiek van deze genen tijdens glucose-uithongering kan beïnvloeden. Figuur 6B toont een voorbeeld van Nrd1 crosslinking naar het Imd3-transcript, waarvan bekend is dat het wordt gereguleerd door Nab343. In dit geval toonden de gegevens een significante vermindering van de binding aan glucose-uithongering. Eerder werk toonde een verminderde binding van Nab3 aan het Tye7-transcript tijdens glucose-uithongering44. In overeenstemming met deze waarneming suggereren de χCRAC-gegevens dat de binding van Nrd1 afnam tijdens glucose-uithongering en dat de kruiskoppeling van Nrd1 met Tye7 het laagst was na 8 minuten stress (figuur 4C). Het lijkt er echter op dat dit effect slechts van voorbijgaande aard was, want na 14 minuten glucose-uithongering ging de Nrd1-binding terug naar de beginniveaus. Figuur 1: Schematische weergave van het χCRAC-protocol. Gelabelde soorten werden gekweekt tot de gewenste dichtheid. RBP duidt op RNA-bindend eiwit. Daarna werd een referentiemonster genomen en verknoopt met 254 nm UV-licht. De resterende cellen werden geoogst door filtratie en vervolgens snel verschoven naar het stress-inducerende medium. Voor het hier beschreven χCRAC-experiment werden monsters genomen en 1, 2, 4, 8, 14 en 20 minuten na de dienst aan elkaar gekoppeld (1). Het RBP van belang werd vervolgens gezuiverd met behulp van een zeer strenge tweestaps affiniteitszuivering (2). Vervolgens werden de gevangen cross-linked RNA’s gedeeltelijk verteerd met RNases, radioactief gelabeld aan het 5′-uiteinde en adapters werden erop geligeerd (3). De 5′-adapters bevatten unieke “in-read” barcodesequenties, zodat de afzonderlijke monsters bioinformatisch konden worden gescheiden na sequencing. De RBP-RNA-complexen werden vervolgens geëlueerd, samengevoegd en samen neergeslagen (4), opgelost door SDS-PAGE en gevisualiseerd door autoradiografie (5). Vervolgens werd een enkele gelplak met het radioactieve signaal net boven de hoofdband, geïllustreerd met een onderbroken rood vak in het autoradiografiebeeld, uit de gel gesneden (5). De plakjes gel werden behandeld met protease K en het RNA werd vervolgens geëxtraheerd (6), omgezet in cDNA’s en versterkt via PCR (7). De PCR-stap introduceerde extra barcodes (geel blok geïntroduceerd door P7 oligo) zodat veel bibliotheken in één rijstrook konden worden gemultiplext. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Cross-linking en vacuümfiltratie. (A) De cross-linker. De celsuspensie wordt in een trechter rechtsboven in de machine gegoten (zie ook figuur 3A voor een close-up) en in een UV-transparante zak in de middelste lade gehouden. Deze zak wordt geflankeerd door twee luiken die gesloten blijven totdat de gebruiker de machine instrueert om de bestralingsstap te starten. De cellen worden bestraald met UV-licht uit de trays zowel boven als onder. De machine wordt geleverd met 254 en 365 nm UV-lampen, waarbij de laatste toepasbaar is voor PAR-CLIP experimenten. De machine wordt bediend via een touchscreen-paneel rechtsboven, waarmee men de UV-dosering of blootstellingstijd kan regelen. (B) Na crosslinking worden de cellen aan de linkerkant van de machine afgevoerd. Celsuspensies worden teruggewonnen door middel van vacuüm en afgetapt in een glazen kolf waar ze vervolgens in een vacuümfiltratie-apparaat kunnen worden gegoten voor het oogsten. (C) Vacuümfiltratie-inrichtingen. Deze worden via een clip geopend en gesloten en er wordt een filter tussen geplaatst. Vier filtratie-apparaten werden parallel gebruikt voor zeer korte tijdreeksen om geen tijd te verliezen als gevolg van het vervangen van filters. D) Na filtratie werd het mediasupernatant in kolven afgetapt om vervolgens te worden verwijderd. Onder de vacuümfiltratie-apparaten werden kleppen geïnstalleerd om het vacuüm in het systeem te behouden wanneer het filter wordt verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Cross-linking van gesuspendeerde versus aanhangende cellen. (A) De cross-linker met de Vari-X-linker kamer voor suspensiecellen. De celcultuur wordt in de monsterinlaat (trechter) in de rechterbovenhoek van de lade gegoten. (B) Lade die plastic of kwarts petrischalen kan bevatten voor het verbinden van hechtende cellen of kleine volumes suspensiecellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Bibliotheekvoorbereiding. (A) Voorbeeld van een autoradiogram van een Nrd1-HTP χCRAC experiment. Het sterke, geconcentreerde signaal vertegenwoordigt het eiwit dat is verknoopt met zeer korte RNA’s, terwijl het uitstrijkje hierboven het eiwit vertegenwoordigt dat is verknoopt met RNA’s van voldoende lengte voor sequencing. (B) Het uitstrijkje werd weggesneden zoals blijkt uit een autoradiogram dat werd gemaakt na gelexcisie. (C) Een representatieve qPCR uit een χCRAC cDNA-bibliotheek. In dit voorbeeld werd de maximale amplificatie van het cDNA bereikt bij 16 cycli. Zo werden 16 cycli gebruikt voor de uiteindelijke versterking. De foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van drie technische qPCR-replicaties. (D) Voorbeeld van een fosforbeeld uit een cDNA-bibliotheek op een 6% TBE-gel. (E) cDNA-lengte- en kwaliteitsanalyse van een op chips gebaseerde capillaire elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: High RNase test iCLIP experiment om crosslinking in zoogdiercellen te testen. Getoond zijn autoradiogrammen van GFP-RBM7 iCLIP-experimenten die de efficiëntie van RNP-herstel over verschillende cross-linking energieën testten. Immunoprecipitaties werden uitgevoerd met behulp van anti-GFP-antilichamen gekoppeld aan magnetische kralen op verknoopte cellen die stabiel GFP-RBM7 tot expressie brachten. Immunoprecipitaten werden geïncubeerd met hoge concentraties RNase I om geassocieerde RNA’s in te korte, uniforme lengtes. RNP’s werden gevisualiseerd door 32P-labeling en SDS-PAGE en migreren als een gedefinieerde band, dicht bij de migratie van het niet-verknoopte eiwit. Kwantificering geeft de resultaten aan van densitometrische analyses van radioactief gelabeld RBM7-RNA-signaal genormaliseerd naar het anti-GFP western blot-signaal. (A) Cross-linking tijdsverloop van de veelgebruikte UVP cross-linker versus onze cross-linker (Vari-X-linker; VxL). (B) Cross-linking time-course van onze cross-linker op kwarts (links) en plastic (rechts) cultureware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Voorbeeld van genoombrowserplots die de kracht van χCRAC laten zien om differentiële, temporele binding van Nrd1 aan zijn doelen weer te geven. Elk vak toont plots voor individuele genomische regio’s. De pijlen geven aan op welke streng de genen zijn gecodeerd (links wijzende pijl = min streng; rechts wijzende pijl = plus streng). De tijdspunten (min) worden aangegeven door t0, t1, t2, etc op de y-assen van elke subplot. Romeinse cijfers die de chromosomen en de coördinaten aangeven, worden weergegeven. (A) Bij glucosedeprivatie bindt Nrd1 twee glucosetransporters met hoge affiniteit, HXT6 en HXT7, die beide in deze toestand upregulated zijn. (B) Nrd1 wordt waargenomen om te binden aan Imd3, een reeds gevalideerd doelwit van Nab344, met een afnemende intensiteit na glucose-uithongering. (C) Nrd1-binding van Tye7 vertoont een dynamisch en voorbijgaand karakter, afnemend na glucose-uithongering tot een minimum na 8 minuten stress. De binding keert echter na 14 minuten terug naar basale niveaus. Reads werden genormaliseerd naar “reads per million” (RPM; y-as). Grijze vakken geven gebieden aan die coderen voor niet-coderende RNA’s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De χCRAC-methode, in combinatie met de nieuwe crosslinking- en celoogstapparaten, heeft een groot potentieel omdat het toepasbaar is op een breed scala van modelorganismen en daarom van algemeen belang zou moeten zijn voor het RNA-veld. Er zijn veel gebieden waarop χCRAC kan worden gebruikt. De methode kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de hiërarchische assemblage van eiwitten in grote macromoleculaire complexen te meten, zoals het spliceosoom en het ribosoom, waarbij vaak dynamische interacties tussen eiwitten en RNA-moleculen betrokken zijn. We gebruiken het nu ook routinematig om interacties tussen RNA-vervalfactoren en hun substraten te volgen wanneer cellen worden blootgesteld aan verschillende soorten spanningen. Dit stelt ons in staat om te bepalen in welk stadium van de adaptieve respons deze factoren het meest actief zijn, aan welke substraten ze binden en hoe dynamisch deze interacties zijn. Dergelijke gegevens moeten onderzoekers in staat stellen de relatieve bijdrage van elke factor aan de aanpassing aan veranderingen in het milieu te bepalen.

χCRAC maakt gebruik van dubbele affiniteitszuiveringslabels (HTF of HTP) om het eiwit te zuiveren onder zeer strenge en denaturerende omstandigheden. Dit zorgt ervoor dat het gecopureerde RNA sterk verrijkt is voor RNA’s die covalent verknoopt waren met het eiwit van belang. Vertrouwen op affiniteitstags heeft echter nadelen. De tag kan bijvoorbeeld interfereren met de eiwitfunctie, wat een vervormde uitlezing van het RNA-bindende interactoom zou kunnen geven. Bovendien is het voor sommige modelorganismen niet altijd mogelijk om tags te gebruiken omdat de genetische hulpmiddelen om DNA-fragmenten in het genoom te integreren of expressieplasmiden te transformeren nog niet beschikbaar zijn. Het is echter eenvoudig om sommige delen van het χCRAC-protocol te wijzigen om het compatibel te maken met CLIP-gebaseerde protocollen die afhankelijk zijn van antilichamen voor de zuivering van de RBP. Deze studie toonde inderdaad aan dat het mogelijk is om iCLIP-gebaseerde zuiveringen te combineren met onze crosslinker. We zijn nu bezig met het ontwikkelen van CLIP-protocollen om de temporele associatie van menselijke RNA-bindende eiwitten met ontluikende RNA-transcripten te bestuderen.

Bij het uitvoeren van χCRAC op een nieuw eiwit moet de UV-blootstelling worden geoptimaliseerd om maximale cross-linking te induceren. Dit is belangrijk omdat hoge UV-blootstellingen het herstel van RNA tijdens de zuiveringsstap kunnen verminderen. Cellen die de recombinante RBP tot expressie brachten, werden blootgesteld aan verschillende UV-doses, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 en 1 J/cm 2. De RNP’s werden vervolgens gevangen en de RNA’s werden gefragmenteerd en radioactief gelabeld. Daarna werden de RNP’s opgelost door SDS-PAGE en werd een autoradiogram gemaakt om af te leiden welke blootstelling het meest intense signaal gaf (d.w.z. de maximale cross-linking).

Zodra de experimentele omstandigheden zijn geoptimaliseerd, worden verschillende controle-experimenten aanbevolen bij het uitvoeren van χCRAC. Ten eerste kan een UV-bestraald, ongelabeld monster worden gebruikt om de achtergrondbinding aan de zuiveringsparels te controleren. Ten tweede, bij het toepassen van χCRAC tijdens een verschuivingsexperiment, maakt een tweede tijdreeks waarbij de cellen terug naar het oorspronkelijke medium worden verplaatst, onderzoek mogelijk naar de vraag of de filtratie van de cellen zelf veranderingen in RNA-niveaus of eiwit-RNA-interacties induceert.

Zoals vermeld in de inleiding, suggereren tal van recent gepubliceerde artikelen een aantal optimalisaties van het CLIP-protocol. Dit omvat het gebruik van fluorescerend gelabelde adapters voor het detecteren van het eiwit-RNA-complex door middel van infraroodscanning10, evenals optimalisaties voor verschillende nucleïnezuurzuiverings- en grootteselectiestappen die zijn aangetoond om de complexiteit van de resulterende bibliotheken te vergroten12,45. We implementeren momenteel enkele van deze verbeteringen om het χCRAC-protocol verder te verfijnen. Het hier gepresenteerde protocol bevat al een aantal verbeteringen ten opzichte van de oorspronkelijke CRAC- en χCRAC-protocollen die de complexiteit van de gegevens vergroten. Bijvoorbeeld, eerder, na het oplossen van de cross-linked, radioactieve proteïne-RNA-complexen op SDS-PAGE-gels, werden ze overgebracht naar een nitrocellulosemembraan en werd het cross-linked RNA geïsoleerd uit de vlek. De overdracht van de RNP en de daaropvolgende RNA-extractie kan echter zeer inefficiënt zijn, vooral wanneer het gaat om grote RBP’s zoals RNA-polymerase-subeenheden. Dit kan resulteren in een significante vermindering van het herstel van het cross-linked RNA. In het huidige protocol wordt het cross-linked RNA rechtstreeks geëxtraheerd uit SDS-PAGE-gelplakken, zoals geïllustreerd in figuur 1. Dit verhoogde het herstel van cross-linked RNA’s. Bovendien werd het product na PCR-amplificatie van de cDNA’s oorspronkelijk opgelost op 3%, agarose-gels met lage smelttemperatuur en vervolgens werden 175-300 bp PCR-producten uit de gel geëxtraheerd. Deze gels kunnen echter gemakkelijk overbelast raken, wat resulteert in een zeer slechte scheiding van het DNA. Het vervangen van agarose-gels door geprefabriceerde TBE-gels resulteerde in een consistentere groottescheiding en een beter herstel van PCR-producten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Wellcome Trust (091549 aan S.G. en 109093/Z/15/A aan S.M.), de Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) en Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 to S.G.), de European Molecular Biology Organization onder een langdurige postdoctorale fellowship (ALTF 1070-2017 tot R.A.C.), en het Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

Materials

1,4-dithioreitol Merck 10708984001 Buffer component in mammalian cell lysis
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086 General reaction tube
2 mL tubes Eppendorf 0030 123.344 For holding columns and collection of waste
32P-yATP Perkin Elmer NEG502Z-250 For radiolabelling the 5' end of the RNA
4-12% Bis-Tris gel Invitrogen NP0321BOX SDS-PAGE gel
4X loading buffer Novex NP0008 Protein loading dye concentrate
50 bp ladder New England Biolabs N3236 Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library
50% PEG NEB B100045 For the L5 linker ligation
6% TBE gel Invitrogen EC6265BOX For separation and purification of the cDNA library
Acetone ACROS Organics 423245000 Washing of TCA-precipitated proteins
anti-FLAG beads Sigma Aldrich M8823-1ML For purifcation of FLAG-tagged RBPs
ATP (100 mM) Thermo Fisher Scientific R0441 For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs
Beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML Buffer component
Biomax MS intensifying screen Sigma Aldrich Z363162-1EA For intensifying the autoradiogram signal
Chloroform Thermo Fisher Scientific 1010219 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 For inhibition of cellular proteases after lysis
Complete supplement mixture -TRP Formedium DCS0149 For preparation of synthetic defined medium
Costar Spin-X 0.22 µm filters Sigma Aldrich CLS8160 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
DNase RQ1 Promega M6101 For DNA digest following cell lysis
dNTPs (10 mM) Sigma Aldrich 4638956001 For reverse transcription and PCR
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10041814 For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen AM9261 For protease K buffer
Exonuclease I New England Biolabs M0293 For degradation of primers following PCR
Glass microfiber filters Whatman 1823-010 For isolating the excised cDNAs following gel extraction
Glucose Formedium GLU03 For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium
Glycogen (20 mg/mL) Roche 10901393001 Precipitation of proteins, RNA and DNA
GST-TEV Homemade Construct and purification protocol is available upon request
Guanidium hydrochloroide Thermo Fisher Scientific 10071503 Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer
IgG beads GE Healthcare 17-0969-01 For purification of protein A-tagged RBPs
Imidazole Sigma Aldrich I2399-100G For elution of captured proteins from Nickel beads
Isoamyl alcohol Thermo Fisher Scientific A393-500 For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Luna Universal One-Step RT-qPCR NEB E3005S For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles
Magnesium chloride Fluka Analytical 63020-1L For PNK buffer
Membrane filters Millipore AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria For vacuum filtration of cells
Micro bio-spin columns Biorad 732-6204 For collecting eluate after gel extraction
Ni-NTA beads Qiagen 30210 For secondary protein capture
NP-40 Sigma Aldrich I8896-100ML Buffer component
Pfu polymerase Promega M7741 For amplification of the cDNA library
Phenol Sigma Aldrich P4682-400ML For phenol-chloroform extraction following RNA purification
Pierce spin columns Thermo Fisher Scientific 69725 For on-column enzymatic reactions
Protease K Roche 3115887001 For degradation of the RBP following gel extraction
Quartz Petri dish UVO3 N/A For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP
Radiography films Amersham 28906843 For autoradiography visualisation
RNAClean XP beads Beckmann A63987 SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs
RNase H New England Biolabs M0297 For degradation of RNAs following reverse transcription
RNase-It Agilent 400720 For RNA digestion
rRNasin Promega N2511 For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889-1KG For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific 7647-14-5 Buffer component
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750-100G Buffer component in mammalian cell lysis
Sodium dodecylsulfate Sigma Aldrich L3771-1KG For protease K buffer
SUPERase-In Invitrogen AM2694 For inhibition of cellular RNases after lysis
SuperScript IV Thermo Fisher Scientific 18090010 For reverse transcription
T4 PNK New England Biolabs M0201 For radiolabelling the 5' end of the RNA
T4 RNA ligase 1 New England Biolabs M0204 For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q NEB M0351S For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs
TBE buffer (10X) Invitrogen 15581-028 For running TBE gels
TEV protease Homemade For eluting captured proteins following FLAG capture
Thermosensitive alkaline phosphatase Promega M9910 For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs
Trichloroacetic acid (100%) Sigma Aldrich T0699-100ML For precipitation of RBP-RNA complexes
Tris hydrochloride Invitrogen 15504-020 Buffer component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100ML Buffer component in mammalian cell lysis
Vari Filter UVO3 N/A Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP
Vari-X-Linker UVO3 N/A Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP
Yeast nitrogen base Formedium CYN0410 For preparation of synthetic defined medium
Zirconia beads Thistle 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria For cell lysis via bead beating
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  2. Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).
  3. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  4. König, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  5. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  6. Aktaş, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
  7. Huppertz, I., et al. iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  8. Li, X., et al. Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).
  9. Rosenberg, M., et al. Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression. Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).
  10. Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
  11. Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs. Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).
  12. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  13. Flynn, R. A., et al. Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes. RNA. 21 (1), 135-143 (2015).
  14. Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).
  15. Sanford, J. R., et al. Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF. PLOS ONE. 3 (10), e3369 (2008).
  16. Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods. 118-119, 24-40 (2017).
  17. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  18. Chen, K., et al. High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).
  19. Ke, S., et al. A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation. Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).
  20. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  21. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  22. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  23. Hwang, H. W., et al. cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation. Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).
  24. Hwang, H. W., et al. PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage. Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).
  25. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  26. Beckmann, B. M. RNA interactome capture in yeast. Methods. 118-119, 82-92 (2017).
  27. Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease. The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).
  28. Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination. PLOS Genetics. 10 (10), e1004632 (2014).
  29. Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
  30. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Molecular Systems Biology. 2, 49 (2006).
  31. Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress. RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).
  32. van Nues, R., et al. Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress. Nature Communications. 8 (1), 12 (2017).
  33. Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
  34. Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité?. Biochimie. 117, 28-36 (2015).
  35. Lingaraju, M., et al. The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Lubas, M., et al. Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex. Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  37. Conrad, N. K., et al. A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II. 유전학. 154 (2), 557-571 (2000).
  38. Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion. Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).
  39. Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast. Genome Biology. 15 (1), R8 (2014).
  40. Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. Dealing with Pervasive Transcription. Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).
  41. van Dijk, E. L., et al. XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast. Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).
  42. Thiebaut, M., et al. Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae. Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).
  43. Merran, J., Corden, J. L. Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism. Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).
  44. Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast. Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).
  45. Buchbender, A., et al. Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol. Methods. , (2019).

Tags

Protein-RNA InteractionKinetic CRACUV CrosslinkingRNA Binding ProteinsRNA ExtractionCell HarvestingTime-resolved AnalysisLive Cell MonitoringStress ResponseAdherent CellsMicroorganisms

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McKellar, S. W., Ivanova, I., van Nues, R. W., Cordiner, R. A., Chauhan, M., Christopoulou, N., Worboys, W., Langford, A., Jensen, T. H., Granneman, S. Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC. J. Vis. Exp. (159), e61027, doi:10.3791/61027 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image