Summary

Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

Le protocole présenté décrit une méthode pour un test d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité des composés de petites molécules.

Abstract

L’analyse d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité sont deux études principales qui peuvent être exécutées utilisant la méthode présentée ci-dessus. Ce protocole fournit une analyse fiable de la morphologie neuronale ainsi que des mesures quantitatives des modifications sur la longueur de la neurite et la localisation des protéines synaptiques et l’abondance lors du traitement avec de petits composés de molécules. En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité peut être effectuée pour évaluer, distinguer et classer les composés chimiques commerciaux en fonction de leur effet potentiel de neurotoxicité développementale.

Même si les lignées cellulaires sont aujourd’hui largement utilisées dans les tests de dépistage composés en neurosciences, elles diffèrent souvent génétiquement et phénotypiquement de leur origine tissulaire. Les cellules primaires, d’autre part, maintiennent des marqueurs et des fonctions importants observés in vivo. Par conséquent, en raison du potentiel de traduction et de la pertinence physiologique que ces cellules pourraient offrir l’essai de néoration et l’évaluation de neurotoxicité peuvent considérablement bénéficier de l’utilisation des cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) comme modèle cellulaire humain primaire.

La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.

Introduction

La croissance de la neurite est un processus fondamental pour la formation du réseau neuronal et la régénération nerveuse1,2. À la suite d’une blessure, l’excroissance de la neurite joue un rôle clé dans la régénération du système nerveux. L’excroissance de neurite est également un élément important de la signalisation extracellulaire en induisant des activités régénératrices neuronales pour améliorer les résultats pour les désordres neurodégénératifs et les dommages neuronaux3,4,5,6.

En maintenant leur potentiel de différenciation dans la production de diverses lignées neuronales, les cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) pourraient fournir un système modèle pour l’étude de la fonction et du développement du système nerveux central (SNC)7,8,9. Le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des HNPC en tant que modèle primaire de cellules humaines offrent un avantage considérable dans les dépistages de découverte de drogue liés à l’excroissance de neurite. Toutefois, l’entretien et l’échelle des modèles de cellules primaires pour les tests à haut débit pourraient prendre beaucoup de temps et10,11,12,13.

En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité est une autre application utilisant les neurones dérivés du HNPC. Il y a des milliers de composés chimiques commerciaux qui ne sont pas examinés ou avec un potentiel de neurotoxicité mal compris. Par conséquent, des expériences de dépistage plus fiables et plus efficaces pour évaluer, distinguer et classer les composés en fonction de leur potentiel pour susciter une neurotoxicité développementale sont très demandées14. L’augmentation de la prévalence et de l’incidence des troubles neurologiques ainsi que l’abondance de composés non testés dans l’environnement nécessite le développement d’expériences plus fiables et efficaces pour identifier les composés environnementaux dangereux qui peuvent poser la neurotoxicité15.

La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.

Protocol

Énoncé d’éthique : Des échantillons fœtaux ont été reçus du Laboratoire de recherche sur les malformations congénitales de l’Université de Washington à Seattle dans le cadre d’un programme de distribution de tissus soutenu par le National Institute of Health (NIH). Le Laboratoire de recherche sur les malformations congénitales a obtenu le consentement écrit approprié des parents et l’achat de tissus a été surveillé par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Washington. Tous le…

Representative Results

Le protocole présenté dans le manuscrit a été utilisé avec succès dans deux articles récemment publiés22,23. La figure 3 démontre l’utilisation de neurones dérivés des HNPC pour examiner l’effet des inhibiteurs du HDAC comme composés épigénétiques sur l’extension des neurites comme marqueur de l’excroissance des neurites et de la capacité neurogénique subséquente des composés de petites molécules. <p c…

Discussion

Ce protocole est l’un des rares articles publiés décrivant le test de longueur de neurite lors du traitement avec des composés d’essai. En outre, nous décrivons comment employer des hNPC pour un essai de neure de excroissance et évaluation de neurotoxicité. En utilisant cet essai d’excroissance de neure et l’évaluation de neurotoxicité sur les neurones dérivés des HNPC, le potentiel neurogénique d’une catégorie de composés épigénétiques à petites molécules, inhibiteurs du HDAC, dans l’induct…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par la subvention de recherche nimad (940714) accordée au CRG.

Materials

4-well Glass Chamber Slides Sigma PEZGS0816
Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001
Alexa Fluor 594 Invitrogen R37117
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062
Anti-β-Tubulin III Thermo MA1-118X
B27 Thermo 17504001
B27 – minus vitamin A Thermo 12587010
BDNF PeproTech 450-02
BSA Sigma A8531
CellTiter-Glo Promega G7572
CoolCell Corning 432000 Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930 Cryopreservation medium containing 10% DMSO
DAPI Thermo D1306
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO Sigma 34869-100ML
EGF Gibco PHG0311
FGF Gibco PHG6015
Formaldehyde Thermo FB002
GDNF PeproTech 450-10
Glutamax Gibco 35050061 L-alanyl-L-glutamine supplement
Goat Serum Thermo 50062Z
Heparin Calbiochem 375095
Laminin Sigma L2020-1MG
L-Ascorbic Acid Sigma A92902-25G
L-lysine Sigma L5501
MEM non-essential amino acids Gibco 11140050
mFreSR StemCell Technologies 5854 Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
N2 Gibco 17502048
NaCl Sigma 71376
Neurobasal Medium Gibco 21103049
Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates Thermo 164610
PBS Thermo 10010-049
Poly‐L‐lysine Sigma P5899-5MG
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo P10144
Retinoic Acid Sigma R2625
Sodium Azide Sigma S2002
StemPro Accutase Gibco A1110501 Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes
Synaptophysin Thermo MA5-14532
Tris Base Sigma 10708976001
Triton X-100 Sigma X100-100ML

References

  1. Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  2. Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
  3. Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024 (2015).
  4. Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
  5. Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
  6. Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
  7. Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
  8. Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
  9. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  10. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
  11. Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
  12. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
  13. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
  14. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507 (2011).
  15. Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
  16. Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer’s disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer’s Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
  17. Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
  18. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  19. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676 (2012).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
  22. Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109 (2019).
  23. Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
  24. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319 (2009).
  25. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  26. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
  27. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659 (2008).
  28. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  29. Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
  30. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
  31. Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).

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Bagheri, A., Razavipour, S. F., Wahlestedt, C., Mowla, S. J., Faghihi, M. A. A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons. J. Vis. Exp. (162), e60955, doi:10.3791/60955 (2020).

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