인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가
1Department of Molecular Genetics, Faculty of Biological Sciences,Tarbiat Modares University, 2Center for Therapeutic Innovation and Department of Psychiatry & Behavioral Sciences,University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 4Persian BayanGene Research and Training Center
Summary
제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.
Abstract
Neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가는 본원에 제시된 방법을 사용하여 수행될 수 있는 2개의 주요 연구이다. 이 프로토콜은 뉴라이트 길이 및 시냅스 단백질 국소화에 대한 수정의 정량적 측정과 함께 뉴런 형태학의 신뢰할 수있는 분석을 제공하고 작은 분자 화합물로 치료시 풍부합니다. 중성염 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 잠재적인 발달 신경 독성 효과에 기초하여 상업적 화학 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기기 위해 수행될 수 있다.
세포주신경과학의 화합물 스크리닝 에세이에서 요즘 널리 사용되고 있지만, 종종 조직 기원과 는 유전적으로 다르습니다. 반면에 1차 세포는 생체 내에서 관찰되는 중요한 마커와 기능을 유지한다. 따라서, 이러한 세포가 중성자 성장 분석및 신경 독성 평가를 제공할 수 있는 번역 잠재력 및 생리적 관련성으로 인해 인간 신경 전구 세포(hNpC)를 1차 인간 세포 모델로 사용하여 상당히 유익할 수 있다.
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있다, 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델.”
Introduction
중성성장은 뉴런 네트워크 형성과 신경재생1,,2의형성에 근본적인 과정이다. 부상 후, neurite 아웃 성장 신경계의 재생에 중요 한 역할을 한다. Neurite 아웃성장은 또한 신경 퇴행성 질환 및 신경 손상에 대한 결과를 향상시키기 위해 신경 재생 활동을 유도하는 세포 외 신호의 중요한 요소입니다3,,4,,5,,6.
다양한 신경 계보를 생성하는 데 있어 분화 잠재력을 유지함으로써, 인간 신경 전구 세포(hNpC)는 중추 신경계(CNS) 기능 및 개발7,,8,,9의연구를 위한 모델 시스템을 제공할 수 있다. 1 차인간 세포 모델로 hNPC의 높은 번역 잠재력 및 생리적 관련성은 neurite 아웃성장 관련 약물 발견 선별에서 상당한 이점을 제공합니다. 그러나, 고처리량 에 대한 1차 세포 모델의 유지 보수 및 스케일링은 시간이 많이 소요되고 노동 집약적인10,,11,,12,,13일수 있다.
중성기 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 hNPC 유래 뉴런을 이용한 또 다른 응용이다. 검사되지 않거나 제대로 이해되지 않는 신경 독성 잠재력을 가진 수천 개의 상업적인 화학 화합물이 있습니다. 따라서, 보다 안정적이고 효과적인 스크리닝 실험은 개발 신경 독성을 유도하는 그들의 잠재력에 기초하여 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기는 데 큰 수요가14이다. 환경에서 테스트되지 않은 화합물의 풍부와 함께 신경 장애의 보급 및 발생률이 증가함에 따라 신경 독성을 유발할 수 있는 위험한 환경 화합물을 식별하기 위해 보다 신뢰할 수 있고 효율적인 실험이필요합니다(15)
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있으며, 이는 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델이다.
Protocol
윤리 성명서: 태아 표본은 국립 보건원(NIH)이 지원하는 조직 분배 프로그램을 통해 시애틀에 있는 워싱턴 대학의 출생 결함 연구소로부터 수신되었습니다. 출생 결함 연구소는 부모로부터 적절한 서면 통보 동의를 얻고 조직의 조달은 워싱턴 대학의 기관 검토 위원회에 의해 모니터링되었다. 모든 작업은 마이애미 대학의 인간 과목 연구 사무소의 승인으로 수행되었다8. <p cla…
Representative Results
원고에 제시 된 프로토콜은 성공적으로 두 개의 최근에 출판 된논문22에서사용되었습니다 22,,23. 도 3은 중성염 아웃성장과 소분자 화합물의 후속 신경유발능력에 대한 마커로서 중성염의 연장에 대한 후성유전학적 화합물로서 HDAC 억제제의 효과를 검사하는 hNpC 유래 뉴런의 사용을 입증한다. 더욱이, <strong cla…
Discussion
이 프로토콜은 시험 화합물을 가진 처리시 neurite 길이에 대한 시험을 설명하는 몇몇 간행된 논문 의 한개입니다. 또한, 우리는 중성자 아웃 성장 분석 및 신경 독성 평가에 hNPC를 사용하는 방법을 설명합니다. hNPC 유래 뉴런에 대한 이러한 중성기 내성장 분석 및 신경 독성 평가를 활용하여 후생유전학 소분자 화합물, HDAC 억제제의 범주의 신경성 잠재력을 유동적으로 유도하여22개의</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIMAD 연구 보조금에 의해 투자되었다 (940714) MAF에 수여.
Materials
| 4-well Glass Chamber Slides | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulin III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | 17504001 | |
| B27 – minus vitamin A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Cell freezing containers ensuring standardized controlled-rate -1℃/minute cell freezing in a -80℃ freezer |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium containing 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF | Gibco | PHG0311 | |
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehyde | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine supplement |
| Goat Serum | Thermo | 50062Z | |
| Heparin | Calbiochem | 375095 | |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-25G | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Serum-free cryopreservation medium designed for the cryopreservation of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Well Polystyrene White Microplates | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly‐L‐lysine | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo | P10144 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Cell dissociation reagent containing proteolytic and collagenolytic enzymes |
| Synaptophysin | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
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Cite This Article
Bagheri, A., Razavipour, S. F., Wahlestedt, C., Mowla, S. J., Faghihi, M. A. A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons. J. Vis. Exp. (162), e60955, doi:10.3791/60955 (2020).