Summary

Untersuchung neurobehavioraler Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Zebrafischlarven

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

Ein detailliertes experimentelles Protokoll wird in diesem Beitrag zur Bewertung der neurobehavioralen Toxizität von Umweltschadstoffen unter Verwendung eines Zebrafischlarvenmodells vorgestellt, einschließlich des Expositionsprozesses und Tests für neurobehaviorale Indikatoren.

Abstract

In den letzten Jahren haben sich immer mehr Umweltschadstoffe als neurotoxisch erwiesen, vor allem in den frühen Entwicklungsstadien von Organismen. Zebrafischlarven sind ein herausragendes Modell für die neurobehaviorale Untersuchung von Umweltschadstoffen. Hier wird ein detailliertes Versuchsprotokoll für die Bewertung der Neurotoxizität von Umweltschadstoffen mit Zebrafischlarven, einschließlich der Entnahme der Embryonen, des Expositionsprozesses, neurobehavioraler Indikatoren, des Testprozesses und Datenanalyse. Außerdem werden die Kulturumgebung, der Expositionsprozess und die experimentellen Bedingungen diskutiert, um den Erfolg des Assays sicherzustellen. Das Protokoll wurde bei der Entwicklung psychopathischer Medikamente, der Erforschung neurotoxischer Umweltschadstoffe, verwendet und kann optimiert werden, um entsprechende Studien zu erstellen oder für mechanistische Studien hilfreich zu sein. Das Protokoll zeigt einen klaren Operationsprozess zur Untersuchung neurobehavioraler Wirkungen auf Zebrafischlarven und kann die Auswirkungen verschiedener neurotoxischer Substanzen oder Schadstoffe aufzeigen.

Introduction

In den letzten Jahren wurden immer mehr Umweltschadstoffe neurotoxisch1,2,3,4. Die Bewertung der Neurotoxizität in vivo nach Exposition gegenüber Umweltschadstoffen ist jedoch nicht so einfach wie die der endokrinen Störung oder der Entwicklungstoxizität. Darüber hinaus hat die frühzeitige Exposition gegenüber Schadstoffen, insbesondere in umweltrelevanten Dosen, in Toxizitätsstudien5,6,7,8zunehmend Aufmerksamkeit erregt.

Zebrafisch wird als Tiermodell etabliert, das für Neurotoxizitätsstudien während der frühen Entwicklung nach der Exposition gegenüber Umweltschadstoffen geeignet ist. Zebrafische sind Wirbeltiere, die sich nach der Befruchtung schneller entwickeln als andere Arten. Die Larven müssen nicht gefüttert werden, da die Nährstoffe im Chorion ausreichen, um sie für 7 Tage nach der Befruchtung zu erhalten (dpf)9. Larven kommen aus dem Chorion bei 2 dpf und entwickeln Verhaltensweisen wie Schwimmen und Drehen, die beobachtet, verfolgt, quantifiziert und automatisch mit Verhaltensinstrumenten10,11,12,13 ab 3-4 dpf14,15,16,17,18analysiert werden können. Darüber hinaus können Hochdurchsatztests auch durch Verhaltensinstrumente realisiert werden. So sind Zebrafischlarven ein herausragendes Modell für die neurobehaviorale Untersuchung von Umweltschadstoffen19. Hier wird ein Protokoll mit Hochdurchsatzüberwachung angeboten, um die neurobehaviorale Toxizität von Umweltschadstoffen auf Zebrafischlarven unter Lichtreizen zu untersuchen.

Unser Labor hat die neurobehaviorale Toxizität von 2,2′,4,4′-Tetrabromodiphenylether (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/Methoxy-2,2′,4,4′-Tetrabromodiphenylether (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-bromiertes Diphenylether (BDE-209), Blei, und kommerziellen chlorierten Paraffinen23 unter Verwendung des vorgelegten Protokolls. Viele Labore verwenden auch das Protokoll, um die neurobehavioralen Auswirkungen anderer Schadstoffe auf Larven oder erwachsene Fische24,25,26,27zu untersuchen. Dieses neurobehaviorale Protokoll wurde verwendet, um mechanistische Unterstützung zu bieten, die zeigt, dass eine niedrig dosierte Exposition gegenüber Bisphenol A und Ersatzbisphenol S eine vorzeitige hypothalamische Neurogenese bei embryonalen Zebrafischeninduzierte 27. Darüber hinaus optimierten einige Forscher das Protokoll, um entsprechende Studien durchzuführen. Eine kürzlich durchgeführte Studie eliminierte die Toxizität von Amyloid-Beta (A) in einem einfachen Zebrafischmodell mit hohem Durchsatz mit Kasein-beschichteten Gold-Nanopartikeln ( Es zeigte sich, dass sich die “Cas AuNPs” in systemischer Zirkulation über die Blut-Hirn-Schranke von Zebrafischlarven translozierten und intracerebral A-42 beschlagnahmten, was Toxizität in einer unspezifischen, chaperonähnlichen Weise hervorrief, die durch die Verhaltenspathologie unterstützt wurde28.

Fortbewegung, Pfadwinkel und soziale Aktivität sind drei neurobehaviorale Indikatoren, die verwendet werden, um die neurotoxischen Auswirkungen von Zebrafischlarven nach der Exposition gegenüber Schadstoffen im vorgestellten Protokoll zu untersuchen. Die Fortbewegung wird anhand des Schwimmabstandes von Larven gemessen und kann nach der Exposition gegenüber Schadstoffen beschädigt werden. Pfadwinkel und soziale Aktivität sind enger mit der Funktion des Gehirns und des zentralen Nervensystems verbunden29. Der Pfadwinkel bezieht sich auf den Winkel des Pfades der Tierbewegung relativ zur Schwimmrichtung30. Im System werden acht Winkelklassen von -180°-+180° eingestellt. Um den Vergleich zu vereinfachen, werden sechs Klassen im Endergebnis definiert als Routinedrehungen (-10° – 0°, 0° + 10°), durchschnittliche Umdrehungen (-10° – 90°, +10° +90°) und reaktionsschnelle Drehungen (-180° – 90°, +90° + +180°) nach unseren vorherigen Studien21,22. Zwei-Fisch-Soziale Aktivität ist grundlegend für Gruppen-Shoaling-Verhalten; hier wird ein Abstand von < 0,5 cm zwischen zwei gültigen Larven als sozialer Kontakt definiert.

Das hier vorgestellte Protokoll zeigt einen klaren Prozess zur Untersuchung neurobehavioraler Wirkungen auf Zebrafischlarven und bietet eine Möglichkeit, die neurotoxischen Wirkungen verschiedener Substanzen oder Schadstoffe aufzudecken. Das Protokoll wird Forschern zugute kommen, die an der Untersuchung der Neurotoxizität von Umweltschadstoffen interessiert sind.

Protocol

Das Protokoll entspricht den Richtlinien, die von der Tierethikkommission der Universität Tongji genehmigt wurden. 1. Zebrafisch-Embryo-Sammlung Legen Sie zwei Paare gesunder erwachsener Tubingen-Zebrafische in der Nacht vor der Exposition in die Laichbox und halten Sie das Geschlechterverhältnis bei 1:1. Entfernen Sie die erwachsenen Fische zurück in das System 30-60 min nach Tageslicht am nächsten Morgen. Entfernen Sie die Embryonen aus dem Laichkasten….

Representative Results

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der neurobehavioralen Auswirkungen von Umweltschadstoffen mit Zebrafischlarven unter Lichtreizen. Die Fortbewegungs-, Pfadwinkel- und sozialen Aktivitätstests werden in der Einleitung definiert. Die Einrichtung der Mikroplatten in den Bewegungs- und Pfadwinkeltests sowie die Bilder der Software sind unten dargestellt. Darüber hinaus werden unsere eigenen Forschungsergebnisse als Beispiele vorgestellt. Zwei Studien zeigen die Bewegungs-…

Discussion

Diese Arbeit liefert ein detailliertes experimentelles Protokoll zur Bewertung der Neurotoxizität von Umweltschadstoffen unter Verwendung von Zebrafischlarven. Zebrafische durchlaufen den Prozess von Embryonen bis zu Larven während der Expositionsphase, was bedeutet, dass eine gute Versorgung der Embryonen und Larven unerlässlich ist. Alles, was die Entwicklung der Embryonen und Larven beeinflusst, kann das Endergebnis beeinflussen. Hier werden die Kulturumgebung, der Belichtungsprozess und die experimentellen Bedingu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (21876135 und 21876136), das National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), die Stiftung von MOE-Shanghai Key Laboratory of Children es Environmental Health (CEH201807-5) und Swedish Research Council (Nr. 639-2013-6913).

Materials

48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

View Video