לימוד השפעות נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים על הזחלים של דגי הזאב
Summary
פרוטוקול ניסיוני מפורט מוצג במאמר זה להערכת רעילות נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים באמצעות מודל הזחלים דג זברה, כולל תהליך החשיפה ובדיקות אינדיקטורים נוירוהתנהגותית.
Abstract
השנים האחרונות יותר ויותר מזהמים סביבתיים הוכחו נוירוטוקסינים, במיוחד בשלבי הפיתוח המוקדמים של אורגניזמים. הזחלים מדגים הם מודל בראש המחקר הנוירותנהגותי של מזהמים סביבתיים. כאן, פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק להערכת רעילות נוירומזהמים סביבתיים באמצעות הזחלים דג זברה, כולל אוסף של העוברים, תהליך החשיפה, אינדיקטורים נוירוהתנהגותית, תהליך הבדיקה, ו . ניתוח נתונים כמו כן, הסביבה התרבותית, תהליך החשיפה והתנאים הניסיוניים נדונים על מנת להבטיח את הצלחת התהליך. הפרוטוקול נעשה שימוש בפיתוח של תרופות פסיכוסטיות, מחקר על מזהמים עצביים סביבתיים, והוא יכול להיות ממוטב כדי לבצע מחקרים מתאימים או להועיל למחקרים מכניסטיים. הפרוטוקול ממחיש תהליך פעולה ברור לחקר השפעות נוירוהתנהגותיות על הזחלים דג זברה יכול לחשוף את ההשפעות של חומרים נוירורעילים שונים או מזהמים.
Introduction
בשנים האחרונות יותר ויותר מזהמים סביבתיים הוכחונוירוטוקסי1,2,3,4. עם זאת, הערכה של רעילות נוירוvivo לאחר החשיפה למזהמים סביבתיים אינו קל כמו זה של הפרעה אנדוקרינית או רעילות התפתחותית. בנוסף, חשיפה מוקדמת למזהמים, בעיקר במינונים הרלוונטיים לסביבה, משכה תשומת לב גוברת ללימודי רעילות5,6,7,8.
Zebrafish הוא הוקם כמודל בעלי חיים עבור מחקרים נוירורעילות במהלך ההתפתחות המוקדמת לאחר חשיפה למזהמים סביבתיים. דג הזבראפיש הינו החוליות המתפתחות מהר יותר ממינים אחרים לאחר ההפריה. הזחלים לא צריכים להיות מוזנים כי החומרים המזינים ב chorion הם מספיק לקיים אותם 7 ימים הפריה (dpf)9. הזחלים יוצאים מן chorion ב ~ 2 dpf ולפתח התנהגויות כגון שחייה והפעלה כי ניתן לצפות, מעקב, כימות, וניתח באופן אוטומטי באמצעות כלי התנהגות10,11,12,13 החל ב 3-4 dpf14,15,16,17,18. בנוסף, ניתן להבין בדיקות תפוקה גבוהה גם באמצעות כלי התנהגות. לפיכך, הזחלים דג זברה הם מודל מצטיין לחקר נוירוהתנהגותית של מזהמים סביבתיים19. כאן, פרוטוקול מוצע באמצעות ניטור תפוקה גבוהה כדי לחקור את הרעילות נוירולוגית של מזהמים סביבתיים על הזחלים של דגים תחת גירויים אור.
המעבדה שלנו למדה רעילות נוירוהתנהגותית של 2, 2 ‘, 4, 4 ‘-tetrabromodiphenyl אתר (bde-47)20,21, 6 ‘-הידרוxy/מתקסי-2, 2 ‘, 4, 4 ‘-טטרארומאודיפנאל אתר (6-הו/מיאו-bde-47)22, deca-ברומיד diפניאיל אתר (bde-209), עופרת, ומסחרי כלוריד קבוקים23 באמצעות הפרוטוקול המוצג. מעבדות רבות משתמשות גם בפרוטוקול כדי ללמוד את ההשפעות הנוירותנהגותיות של מזהמים אחרים על הזחלים או דגים מבוגרים24,25,26,27. זה פרוטוקול נוירו התנהגותי שימש כדי לסייע לספק תמיכה מכניסטית מראה כי חשיפה במינון נמוך כדי בינתנול A והחלפת בינול המושרה מוקדם היפותלמי נוירוגנזה ב דג זברה העובריים27. בנוסף, חלק מהחוקרים ממוטבים את הפרוטוקול לביצוע מחקרים תואמים. מחקר שנערך לאחרונה ביטלה את הרעילות של ביתא עמילואיד (Aβ) במודל קל, תפוקה גבוהה מודל דג זברה באמצעות מצופה קזאין חלקיקי זהב (βCas אונפס). זה הראה כי βCas אונפס במחזור מערכתי ממוקם על פני מחסום הדם-מוח של הזחלים דג זברה ו מגרם aβ 42, מעורר רעילות באופן לא ספציפי, כמו המלווה, אשר נתמך על ידי פתולוגיה התנהגותית28.
תנועה, זווית הנתיב, והפעילות החברתית הם שלושה אינדיקטורים נוירוהתנהגותית המשמשים לחקר ההשפעות הנוירורעילות של הזחלים דג זברה לאחר חשיפה מזהמים בפרוטוקול המוצג. תנועה נמדד על-ידי המרחק השוחה של הזחלים ועלול להינזק לאחר חשיפה למזהמים מזהמים. זווית הנתיב והפעילות החברתית קשורים קשר הדוק יותר לתפקוד המוח ומערכת העצבים המרכזית29. זווית השביל מתייחסת לזווית הדרך של התנועה בעלי חיים ביחס לכיוון השחייה30. שמונה מחלקות זווית מ ~-180 °-~ + 180 ° מוגדרות במערכת. כדי לפשט את ההשוואה, שישה שיעורים בתוצאה הסופית מוגדרים כתורים שגרתיים ( -10 ° ~ 0 °, 0 ° ~ + 10 °), ממוצע פונה ( -10 ° ~-90 °, + 10 ° ~ + 90 °), והפניות מגיבות (-180 ° ~-90 °, + 90 ° ~ + 180 °) על פי המחקרים הקודמים שלנו21 הפעילות החברתית של שני הדגים היא בסיסית של התנהגות משוצבת הקבוצה; כאן מרחק של < 0.5 ס מ בין שני הזחלים התקפים מוגדר כאיש קשר חברתי.
הפרוטוקול המוצג כאן ממחיש תהליך ברור לחקר השפעות נוירוהתנהגותיות על הזחלים דג זברה ומספק דרך לחשוף את ההשפעות הנוירורעילות של חומרים שונים או מזהמים. הפרוטוקול יועיל לחוקרים המעוניינים ללמוד את הרעילות העצבית של מזהמים סביבתיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מספקת פרוטוקול ניסיוני מפורט להערכת הרעילות של מזהמים סביבתיים באמצעות הזחלים דג זברה. במהלך תקופת החשיפה, מגיע התהליך מעוברים אל הזחלים, כלומר הטיפול הטוב של העוברים והזחלים חיוני. כל דבר המשפיע על התפתחות העוברים והזחלים יכול להשפיע על התוצאה הסופית. כאן הסביבה התרבותית, תהליך …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה על התמיכה הפיננסית על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (21876135 ו 21876136), הלאומית המדע והטכנולוגיה פרוייקט של סין (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), הבסיס של מו-שנגחאי מעבדת מפתח של בריאות הסביבה לילדים (CEH201807) ומועצת המחקר השבדית (מס ‘ 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
References
- Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
- Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
- Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
- Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
- Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
- Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
- Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
- Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
- Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
- Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
- Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
- Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
- Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
- Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
- Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
- Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
- Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
- Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
- Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
- Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
- Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
- Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
- Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
- Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
- Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
- Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
- Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
- Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
- Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
- Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
- Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
- Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
- Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
- Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).
