Summary

Quantificazione dei livelli di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia dello spazio della testa

Published: February 11, 2020
doi:

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare i livelli di etanolo in un embrione di pesce zebra utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa da metodi di esposizione adeguati alla lavorazione degli embrioni e all’analisi dell’etanolo.

Abstract

I disturbi dello spettro dell’alcolfe fetale (FASD) descrivono un continuum altamente variabile di difetti dello sviluppo indotti dall’etanolo, tra cui dismofomorfologie facciali e disturbi neurologici. Con una patologia complessa, FASD colpisce circa 1 bambino su 100 nati negli Stati Uniti ogni anno. A causa della natura altamente variabile della FASD, i modelli animali si sono dimostrati critici nella nostra attuale comprensione meccanicistica dei difetti di sviluppo indotti dall’etanolo. Un numero crescente di laboratori si è concentrato sull’utilizzo del pesce zebra per esaminare i difetti dello sviluppo indotti dall’etanolo. I pesci zebra producono un gran numero di embrioni emblari traslucidi, geneticamente trattivi, che sono esportati esternamente. Ciò consente ai ricercatori di controllare con precisione la tempistica e il dosaggio dell’esposizione all’etanolo in più contesti genetici e di quantificare l’impatto dell’esposizione all’etanolo embrionale attraverso tecniche di imaging dal vivo. Questo, combinato con l’elevato grado di conservazione della genetica e dello sviluppo con gli esseri umani, ha dimostrato che il pesce zebra è un modello potente in cui studiare la base meccanicistica della teratogenicità dell’etanolo. Tuttavia, i regimi di esposizione all’etanolo hanno variato tra diversi studi sui pesci zebra, il che ha confuso l’interpretazione dei dati dei pesci zebra in questi studi. Ecco un protocollo per quantificare le concentrazioni di etanolo negli embrioni di pesce zebra utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa.

Introduction

I disturbi dello spettro dell’alcolfe fetale (FASD) descrivono una vasta gamma di menomazioni neurologiche e dismorfologie craniofacciali associate all’esposizione all’etanolo embrionale1. Molteplici fattori, tra cui la tempistica e il dosaggio dell’esposizione all’etanolo e il background genetico, contribuiscono alla variazione del FASD2,3. Nell’uomo, la complessa relazione di queste variabili rende difficile lo studio e la comprensione dell’eziologia della FASD. I modelli animali si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione della base meccanicistica della teratogenicità dell’etanolo. Un’ampia varietà di sistemi di modelli animali è stata utilizzata per studiare molteplici aspetti della FASD e i risultati sono stati notevolmente coerenti con quanto si trova nell’esposizionenell’uomo 4. I sistemi modello Roditori sono utilizzati per esaminare molti aspetti del FASD, con i topi che sono i più comuni5,6,7. La maggior parte di questo lavoro si è concentrata sui difetti dello sviluppo per l’esposizione precoce all’etanolo8, anche se in seguito l’esposizione all’etanolo ha dimostrato di causare anomalie dello sviluppo pure9. Inoltre, le capacità genetiche dei topi hanno notevolmente aiutato nella nostra capacità di sondare le basi genetiche di FASD10,11. Questi studi sui topi suggeriscono fortemente che ci sono interazioni gene-etanolo con il percorso riccio sonoro, segnalazione dell’acido retinoico, dismutasi Superossido, sintesi di ossido nitrico I, Aldh2 e Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18 19,20,21. Questi studi dimostrano che i modelli animali sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione della FASD e dei suoi meccanismi sottostanti.

Il pesce zebra è emerso come un potente sistema modello per esaminare molti aspetti della teratogenesi dell’etanolo22,23. A causa della loro fecondazione esterna, dell’elevata fecondità, della trattatibilità genetica e delle capacità di imaging dal vivo, i pesci zebra sono ideali per studiare fattori come tempismo, dosaggio e genetica della teratogenesi dell’etanolo. L’etanolo può essere somministrato a embrioni messi in scena con precisione e gli embrioni possono quindi essere immagine per esaminare l’impatto diretto dell’etanolo durante i processi di sviluppo. Questo lavoro può essere correlato direttamente agli esseri umani, perché i programmi genetici di sviluppo sono altamente conservati tra il pesce zebra e gli esseri umani e può quindi aiutare a guidare gli studi umani FASD24. Mentre il pesce zebra è stato utilizzato per esaminare la teratogenesi dell’etanolo, la mancanza di consenso nel segnalare concentrazioni di etanolo embrionale rende difficile il confronto con gli esseri umani25. Nei sistemi dei mammiferi, i livelli di alcol nel sangue sono correlati direttamente ai livelli di etanolo tissutale26. Molti degli studi sui pesci zebra trattano gli embrioni prima della formazione completa del loro sistema circolatorio. Senza un campione materno da esaminare, è necessario un processo per valutare le concentrazioni di etanolo per quantificare i livelli di etanolo all’interno dell’embrione. Qui descriviamo un processo per quantificare le concentrazioni di etanolo in un embrione di pesce zebra in via di sviluppo utilizzando la cromatografia del gas dello spazio della testa.

Protocol

Tutti gli embrioni di pesce zebra utilizzati in questa procedura sono stati allevati e allevati seguendo i protocolli IACUC stabiliti27. Questi protocolli sono stati approvati dall’Università del Texas ad Austin e dall’Università di Louisville. NOTA: La linea di pesce zebra Tg(fli1:EGFP)y1 è stata utilizzata in questo studio28. Tutta l’acqua utilizzata in questa procedura è acqua sterile di osmosi inversa. Tutte le analis…

Representative Results

I livelli di etanolo sanguigno non possono essere determinati nei primi pesci zebra embrionali, perché non hanno un sistema circolatorio completamente formato. Per determinare il livello di concentrazione di etanolo negli embrioni di pesce zebra, i livelli di etanolo sono misurati direttamente dal tessuto embrionale omogeneizzato. Per misurare correttamente le concentrazioni di etanolo embrionale, è necessario tener conto del volume embrionale. L’embrione (tuorlo attaccato) si trova all’interno del chorion (guscio d’uo…

Discussion

Come sistema di modelli di sviluppo, il pesce zebra è ideale per studiare l’impatto dei fattori ambientali sullo sviluppo. Producono un gran numero di embrioni fecondati esternamente, il che consente di tempistica precisa e paradigmi di dosaggio negli studi sull’etanolo. Questo, combinato con le capacità di imaging dal vivo e la conservazione genetica e dello sviluppo con gli esseri umani, rende il pesce zebra un potente sistema modello per gli studi di teratologia. Descritto è un protocollo per misurare le concentraz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca presentata in questo articolo è stata supportata da precedenti sovvenzioni da National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 a J.K.E. e National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 a C.B.L. e con l’attuale sovvenzione da parte dei National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L. Ringraziamo Rueben Gonzales per aver fornito e assistito l’analisi del cromatografo a gas. Ringraziamo Tiahna Ontiveros e la dott.ssa Gina Nobles a scrivere assistenza.

Materials

Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

References

  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol’s molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
  27. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. 발생학. 248 (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).

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Cite This Article
Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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