La mappatura dei circuiti assistiti da channelrhodopsin (CRACM) è una tecnica di precisione per la mappatura funzionale delle proiezioni neuronali a lungo raggio tra gruppi di neuroni anatomicamente e/o geneticamente identificati. Qui, descriviamo come utilizzare CRACM per mappare le connessioni uditive del tronco, incluso l’uso di un opsin in rosso, ChrimsonR.
Quando si studiano i circuiti neurali, una limitazione standard dell’approccio di morsetto patch in vitro è che gli assoni provenienti da più fonti sono spesso intermixed, rendendo difficile isolare gli input da singole fonti con stimolazione elettrica. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assistited circuit mapping (CRACM), questa limitazione può ora essere superata. Qui, riportiamo un metodo per utilizzare CRACM per mappare gli input ascendenti da nuclei del tronco encefalico meno bassi uditivi e input commissurali a una classe identificata di neuroni nel collicolo inferiore (IC), il nucleo midbrain del sistema uditivo. Nell’IC, gli assoni locali, commissri, ascendenti e discendenti sono fortemente intrecciati e quindi indistinguibili dalla stimolazione elettrica. Iniettando un costrutto virale per guidare l’espressione di una channelrhodopsin in un nucleo presintatico, seguita dalla registrazione dei blocchi di patch per caratterizzare la presenza e la fisiologia degli ingressi sinaptici che esprimono channelrhodopsin, proiezioni da una fonte specifica a una popolazione specifica di neuroni IC possono essere mappati con precisione specifica del tipo di cellula. Dimostriamo che questo approccio funziona sia con Chronos, una channelrhodopsin ad attivazione della luce blu, sia con ChrimsonR, una channelrhodopsin con cambio rosso. In contrasto con i precedenti rapporti dal prosencefalo, troviamo che ChrimsonR è robustamente trafficato lungo gli assi dei neuroni principali del nucleo cocleare dorsale, indicando che ChrimsonR può essere uno strumento utile per gli esperimenti CRACM nel tronco encefalico. Il protocollo qui presentato include descrizioni dettagliate della chirurgia di iniezione di virus intracranico, incluse le coordinate stereotassiche per indirizzare le iniezioni al nucleo cocleare dorsale e all’IC dei topi, e come combinare la registrazione dei morsetti a tutta cella con attivazione della channelrhodopsin per studiare le proiezioni a lungo raggio ai neuroni IC. Anche se questo protocollo è adattato per caratterizzare gli input uditivi all’IC, può essere facilmente adattato per studiare altre proiezioni a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo e oltre.
Le connessioni sinaptiche sono fondamentali per la funzione del circuito neurale, ma la topologia precisa e la fisiologia delle sinapsi all’interno dei circuiti neurali sono spesso difficili da sondare sperimentalmente. Questo perché la stimolazione elettrica, lo strumento tradizionale dell’elettrofisiologia cellulare, attiva indiscriminatamente gli assoni vicino al sito di stimolazione, e nella maggior parte delle regioni cerebrali, gli assoni provenienti da fonti diverse (locali, ascendenti e/o discendenti) si intrecciano. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, questa limitazione può ora essere superata3. La channelrhodopsin (ChR2) è un canale ionico selettivo di luce originariamente presente nell’alga verde Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 può essere attivato dalla luce blu di una lunghezza d’onda intorno a 450-490 nm, depolarizzando la cellula attraverso l’afflusso di cation. ChR2 è stato descritto ed espresso per la prima volta in Xenopus oocytes da Nagel e colleghi4. Poco dopo, Boyden e colleghi5 hanno espresso ChR2 nei neuroni mammiferi e hanno dimostrato che potrebbero utilizzare impulsi di luce per controllare in modo affidabile l’abbagliamento su una scala temporale di millisecondi, inducendo potenziali di azione 10 ms dopo l’attivazione di ChR2 con luce blu. I canali optogenetici con cinetica ancora più veloce sono stati trovati di recente (ad esempio, Chronos6).
L’approccio di base a un esperimento CRACM è quello di transfetare una popolazione di neuroni pressinaptici putativi con un virus ricombinante adeno-associato (rAAV) che trasporta le informazioni genetiche per una channelrhodopsin. La trasfezione dei neuroni con rAAV porta all’espressione della channelrhodopsin codificata. Tipicamente, la channelrhodopsin è etichettata con una proteina fluorescente come GFP (Green Fluorescent Protein) o tdTomato (una proteina fluorescente rossa), in modo che la trasfezione dei neuroni nella regione bersaglio possa essere facilmente confermata con l’imaging di fluorescenza. Poiché i RAAV sono non patogeni, hanno un basso potenziale infiammatorio e un’espressione genica di lunga durata7,8, sono diventati una tecnica standard per fornire channelrhodopsins ai neuroni. Se, dopo la trasfezione di una popolazione pressiratica putativa di neuroni, l’attivazione di una channelrhodopsin attraverso lampi di luce suscita potenziali post-sinaptici o correnti nei neuroni bersaglio, questa è la prova di una connessione assonale dal nucleo trascurato alla cellula registrata. Poiché gli assoni recisi negli esperimenti sulle fette cerebrali possono essere spinti a rilasciare il neurotrasmettitore attraverso l’attivazione della channelrhodopsin, i nuclei che si trovano al di fuori della fetta acuta ma inviano assoni nella regione post-sinaptica del cervello possono essere identificati con CRACM. La potenza di questa tecnica è che la connettività e la fisiologia degli input sinaptici a lungo raggio identificati possono essere studiate direttamente.
Oltre alle channelrhodopsins che sono eccitabili dalla luce blu, gli investigatori hanno recentemente identificato diverse channelrhodopsins rosso-shifted9,10, tra cui Chrimson e la sua più veloce analogico ChrimsonR, entrambi i quali sono eccitati con la luce rossa di 660 nm6. Opsins rosso-spostato sono di interesse perché la luce rossa penetra tessuto meglio della luce blu, e la luce rossa può avere una citotossicità inferiore rispetto alla luce blu10,11,12. Le channelrhodopsins spostate in rosso aprono anche la possibilità di esperimenti CRACM a doppio colore, dove la convergenza di assoni da nuclei diversi sullo stesso neurone può essere testata in un esperimento6,13,14. Tuttavia, gli attuali opsin rossi spesso presentano un’attivazione incrociata indesiderata con luce blu15,16,17, rendendo difficili due esperimenti di colore. Inoltre, alcuni rapporti hanno indicato che ChrimsonR subisce un traffico assonale limitato, il che può rendere difficile l’utilizzo di ChrimsonR per esperimenti CRACM16,17.
Quasi tutte le proiezioni ascendenti dai nuclei del tronco encefalico meno basso convergono nel collicolo inferiore (IC), il centro cerebrale del percorso uditivo centrale. Questo include proiezioni dal nucleo cocleare (CN)18,19, la maggior parte del complesso di oliva superiore (SOC)20, e i nuclei dorsali (DNLL) e ventrale (VNLL) del lemniscus laterale21. Inoltre, una grande proiezione discendente dalla corteccia uditiva termina nei neuroni IC18,19,20,21,22e IC stessi si napsi ampiamente all’interno dei lobi locali e contralaterali dell’IC23. L’intreccio di assoni provenienti da molte fonti ha reso difficile sondare circuiti IC utilizzando la stimolazione elettrica24. Di conseguenza, anche se i neuroni nell’IC eseguono calcoli importanti per la localizzazione del suono e l’identificazione del discorso e di altri suoni di comunicazione25,26, l’organizzazione dei circuiti neurali nell’IC è in gran parte sconosciuta. Recentemente abbiamo identificato i neuroni VIP come la prima classe di neuroni identificabili molecolarmente nell’IC27. I neuroni VIP sono neuroni stellati glutamatergici che proiettano su diversi obiettivi a lungo raggio, tra cui il talamo uditivo e il collicolo superiore. Ora siamo in grado di determinare le fonti e la funzione degli input locali e a lungo raggio ai neuroni VIP e di determinare come queste connessioni di circuito contribuiscono all’elaborazione del suono.
Il protocollo qui presentato è basato su misura per studiare gli input sinaptici ai neuroni VIP nell’IC dei topi, in particolare dall’IC contralaterale e dal DCN (Figura 1). Il protocollo può essere facilmente adattato a diverse fonti di input, un diverso tipo di neurone o una regione del cervello diversa del tutto. Dimostriamo anche che ChrimsonR è un’efficace channelrhodopsin con spostamento rosso per la mappatura dei circuiti a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo. Tuttavia, dimostriamo che ChrimsonR è fortemente attivato dalla luce blu, anche a bassa intensità, e quindi, per combinare ChrimsonR con Chronos in esperimenti CRACM a due colori, è necessario utilizzare controlli accurati per prevenire l’attivazione incrociata di ChrimsonR.
Abbiamo scoperto che CRACM è una tecnica potente per identificare e caratterizzare gli input sinaptici a lungo raggio ai neuroni nel mouse IC. Seguendo il protocollo qui descritto, abbiamo ottenuto una robusta trasfezione dei neuroni nella DCN e nell’IC, nonché un affidabile traffico assonale di Chronos e ChrimsonR nei terminali sinaptici nell’IC. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa tecnica consente la misurazione e l’analisi di eventi post-sinaptici, tra cui ampiezza PSP, mezza larghezza, tempo di decadimento e far…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da una Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, progetto numero 401540516, alla DG) e national Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
Fixed stage microscope | any | n/a | |
Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
Heating pad | Custom build | N/A | |
Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
Standard chemicals | local vendors | N/A | |
standard imaging solutions | |||
Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
Temperature controller | Custom build | N/A | |
Vibratome | any | n/a | |
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
Water bath | any | n/a |