Mappatura del circuito a lungo raggio assistita da Channelrhodopsin dei neuroni Colliculus inferiori con Channelrhodopsins blu e rosso

Le connessioni sinaptiche sono fondamentali per la funzione del circuito neurale, ma la topologia precisa e la fisiologia delle sinapsi all’interno dei circuiti neurali sono spesso difficili da sondare sperimentalmente. Questo perché la stimolazione elettrica, lo strumento tradizionale dell’elettrofisiologia cellulare, attiva indiscriminatamente gli assoni vicino al sito di stimolazione, e nella maggior parte delle regioni cerebrali, gli assoni provenienti da fonti diverse (locali, ascendenti e/o discendenti) si intrecciano. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)^1,2, questa limitazione può ora essere superata³. La channelrhodopsin (ChR2) è un canale ionico selettivo di luce originariamente presente nell’alga verde Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 può essere attivato dalla luce blu di una lunghezza d’onda intorno a 450-490 nm, depolarizzando la cellula attraverso l’afflusso di cation. ChR2 è stato descritto ed espresso per la prima volta in Xenopus oocytes da Nagel e colleghi⁴. Poco dopo, Boyden e colleghi⁵ hanno espresso ChR2 nei neuroni mammiferi e hanno dimostrato che potrebbero utilizzare impulsi di luce per controllare in modo affidabile l’abbagliamento su una scala temporale di millisecondi, inducendo potenziali di azione 10 ms dopo l’attivazione di ChR2 con luce blu. I canali optogenetici con cinetica ancora più veloce sono stati trovati di recente (ad esempio, Chronos⁶).

L’approccio di base a un esperimento CRACM è quello di transfetare una popolazione di neuroni pressinaptici putativi con un virus ricombinante adeno-associato (rAAV) che trasporta le informazioni genetiche per una channelrhodopsin. La trasfezione dei neuroni con rAAV porta all’espressione della channelrhodopsin codificata. Tipicamente, la channelrhodopsin è etichettata con una proteina fluorescente come GFP (Green Fluorescent Protein) o tdTomato (una proteina fluorescente rossa), in modo che la trasfezione dei neuroni nella regione bersaglio possa essere facilmente confermata con l’imaging di fluorescenza. Poiché i RAAV sono non patogeni, hanno un basso potenziale infiammatorio e un’espressione genica di lunga durata^7,8, sono diventati una tecnica standard per fornire channelrhodopsins ai neuroni. Se, dopo la trasfezione di una popolazione pressiratica putativa di neuroni, l’attivazione di una channelrhodopsin attraverso lampi di luce suscita potenziali post-sinaptici o correnti nei neuroni bersaglio, questa è la prova di una connessione assonale dal nucleo trascurato alla cellula registrata. Poiché gli assoni recisi negli esperimenti sulle fette cerebrali possono essere spinti a rilasciare il neurotrasmettitore attraverso l’attivazione della channelrhodopsin, i nuclei che si trovano al di fuori della fetta acuta ma inviano assoni nella regione post-sinaptica del cervello possono essere identificati con CRACM. La potenza di questa tecnica è che la connettività e la fisiologia degli input sinaptici a lungo raggio identificati possono essere studiate direttamente.

Oltre alle channelrhodopsins che sono eccitabili dalla luce blu, gli investigatori hanno recentemente identificato diverse channelrhodopsins rosso-shifted^9,10, tra cui Chrimson e la sua più veloce analogico ChrimsonR, entrambi i quali sono eccitati con la luce rossa di 660 nm⁶. Opsins rosso-spostato sono di interesse perché la luce rossa penetra tessuto meglio della luce blu, e la luce rossa può avere una citotossicità inferiore rispetto alla luce blu^10,11,12. Le channelrhodopsins spostate in rosso aprono anche la possibilità di esperimenti CRACM a doppio colore, dove la convergenza di assoni da nuclei diversi sullo stesso neurone può essere testata in un esperimento^6,13,14. Tuttavia, gli attuali opsin rossi spesso presentano un’attivazione incrociata indesiderata con luce blu^15,16,17, rendendo difficili due esperimenti di colore. Inoltre, alcuni rapporti hanno indicato che ChrimsonR subisce un traffico assonale limitato, il che può rendere difficile l’utilizzo di ChrimsonR per esperimenti CRACM^16,17.

Quasi tutte le proiezioni ascendenti dai nuclei del tronco encefalico meno basso convergono nel collicolo inferiore (IC), il centro cerebrale del percorso uditivo centrale. Questo include proiezioni dal nucleo cocleare (CN)^18,19, la maggior parte del complesso di oliva superiore (SOC)²⁰, e i nuclei dorsali (DNLL) e ventrale (VNLL) del lemniscus laterale²¹. Inoltre, una grande proiezione discendente dalla corteccia uditiva termina nei neuroni IC^18,19,20,^21,22e IC stessi si napsi ampiamente all’interno dei lobi locali e contralaterali dell’IC²³. L’intreccio di assoni provenienti da molte fonti ha reso difficile sondare circuiti IC utilizzando la stimolazione elettrica²⁴. Di conseguenza, anche se i neuroni nell’IC eseguono calcoli importanti per la localizzazione del suono e l’identificazione del discorso e di altri suoni di comunicazione^25,26, l’organizzazione dei circuiti neurali nell’IC è in gran parte sconosciuta. Recentemente abbiamo identificato i neuroni VIP come la prima classe di neuroni identificabili molecolarmente nell’IC²⁷. I neuroni VIP sono neuroni stellati glutamatergici che proiettano su diversi obiettivi a lungo raggio, tra cui il talamo uditivo e il collicolo superiore. Ora siamo in grado di determinare le fonti e la funzione degli input locali e a lungo raggio ai neuroni VIP e di determinare come queste connessioni di circuito contribuiscono all’elaborazione del suono.

Il protocollo qui presentato è basato su misura per studiare gli input sinaptici ai neuroni VIP nell’IC dei topi, in particolare dall’IC contralaterale e dal DCN (Figura 1). Il protocollo può essere facilmente adattato a diverse fonti di input, un diverso tipo di neurone o una regione del cervello diversa del tutto. Dimostriamo anche che ChrimsonR è un’efficace channelrhodopsin con spostamento rosso per la mappatura dei circuiti a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo. Tuttavia, dimostriamo che ChrimsonR è fortemente attivato dalla luce blu, anche a bassa intensità, e quindi, per combinare ChrimsonR con Chronos in esperimenti CRACM a due colori, è necessario utilizzare controlli accurati per prevenire l’attivazione incrociata di ChrimsonR.