Summary

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Published: January 12, 2020
doi:

Summary

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Abstract

Describimos una técnica para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en Drosophila. Usamos un tinte lipofílico disuelto con aceite y entregamos una pequeña gota a una preparación de filete embrionario por un microinyector. Cada neurona motora cuya membrana es contactada por la gota puede entonces ser etiquetada rápidamente. Las neuronas motoras individuales se etiquetan continuamente, lo que permite visualizar claramente los detalles estructurales finos. Dado que los colorantes lipofílicos vienen en varios colores, la técnica también proporciona un medio para conseguir neuronas adyacentes etiquetadas en multicolor. Esta técnica de rastreo es por lo tanto útil para el estudio de la morfogénesis neuronal y la conectividad sináptica en el sistema de neuronas motoras de Drosophila.

Introduction

El sistema de neuronas motoras embrionarias de Drosophila ofrece un potente modelo experimental para analizar los mecanismos subyacentes al desarrollo del sistema nervioso central (SNC)1,2,3. El sistema de neuronas motoras es susceptible de técnicas bioquímicas, genéticas, de imágenes y electrofisiológicas. Utilizando las técnicas, las manipulaciones genéticas y los análisis funcionales se pueden llevar a cabo a nivel de neuronas motoras individuales2,4,5,6.

Durante el desarrollo temprano del sistema nervioso, los neuroblastos se dividen y generan un gran número de glia y neuronas. La relación espaciotemporal entre la delaminación y el perfil de expresión génica de los neuroblastos se ha investigado previamente en detalle7,8,9. En el caso del sistema de neuronas motoras, la formación de unión neuromuscular embrionaria (NMJ) se ha estudiado ampliamente utilizando el aCC (célula de esquina anterior), RP2 (camarón crudo 2), y las neuronas motoras RP52,10. Por ejemplo, cuando la neurona motora RP5 forma una unión sináptica naciente, la filopodia presináptica y postsináptica se entremezclanitora 11,12,13. Dicha comunicación celular directa es vital para iniciar la formación de NMJ. Contrariamente a lo que sabemos sobre las ramas nerviosas periféricas, nuestro conocimiento de cómo las dendritas motoras inician la conectividad sináptica dentro del SNC sigue siendo primitivo.

En este informe, presentamos una técnica que permite el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en embriones mediante la administración mediada por micropipette de colorantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear las 38 neuronas motoras que inertan cada uno de los 30 músculos de la pared corporal en un hemisegmento a las 15 h después de la puesta de huevos (AEL)14. Mediante el uso de esta técnica, nuestro grupo ha investigado a fondo numerosos alelos de ganancia de función/pérdida de función15,16,17. Recientemente hemos desentrañado los mecanismos moleculares que impulsan el inicio de la conectividad de dendrita motora y hemos demostrado que una interacción Dscam1-Dock-Pak define el sitio de crecimiento de dendrita en la neurona motora aCC17. En general, esta técnica es adaptable para el análisis fenotípico de cualquier neurona motora embrionaria en cepas de tipo salvaje o mutantes, mejorando nuestra capacidad de proporcionar nuevos conocimientos sobre el diseño funcional del sistema nervioso Drosophila.

Protocol

1. Equipos y suministros Materiales para recoger embriones y entrenar a adultos para poner óvulos Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa.NOTA: Alternativamente, los coladores celulares con poros de 100 m(Tabla de Materiales)se pueden utilizar para el paso de filtración de la recolección de embriones. …

Representative Results

Una imagen representativa de las neuronas motoras aCC y RP3 se muestra en la Figura 3C para demostrar el etiquetado multicolor de las neuronas motoras a 15 h AEL. Sus morfologías dendríticas son en gran medida invariables entre embriones. El patrón de tinción obtenido con anticuerpos anti-HRP se muestra en gris. Una pequeña gota de DiO o DiD fue depositada en el NMJ del músculo 1 o 6/7, respectivamente. La Figura 4 demuestra la capacidad d…

Discussion

El uso del etiquetado de tintes para estudiar la morfología neuronal tiene varias ventajas sobre las técnicas genéticas de etiquetado celular. La técnica de etiquetado de tintes puede minimizar la cantidad de tiempo necesario para etiquetar e tomar imágenes de las morfologías de las neuronas motoras. El proceso de etiquetado del tinte es bastante rápido, ya que toma menos de 2 h y nos permite definir el contorno de las proyecciones neuronales. Como alternativa, se puede visualizar la neurona motora aCC eligiendo u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros del Laboratorio Kamiyama por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. y D.K.).

Materials

10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22×22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

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Cite This Article
Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

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