Summary

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Published: January 12, 2020
doi:

Summary

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Abstract

Descrevemos uma técnica para rotulagem retrógrada de neurônios motores em Drosophila. Usamos um corante lipofílico dissolvido em óleo e entregamos uma pequena gota para uma preparação de filé embrionário por um microinjetor. Cada neurônio motor cuja membrana é contatada pela gotícula pode então ser rapidamente rotulado. Neurônios motores individuais são continuamente rotulados, permitindo que detalhes estruturais finos sejam claramente visualizados. Dado que os corantes lipofílicos vêm em várias cores, a técnica também fornece um meio para obter neurônios adjacentes rotulados em multicolor. Esta técnica de rastreamento é, portanto, útil para estudar morgênese neuronal e conectividade sináptica no sistema de neurônios motores de Drosophila.

Introduction

O sistema de neurônio motor embrionário de Drosophila oferece um poderoso modelo experimental para analisar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)1,2,3. O sistema de neurônios motores é passível de técnicas bioquímicas, genéticas, de imagem e eletrofisiológicas. Usando as técnicas, manipulações genéticas e análises funcionais podem ser realizadas no nível dos neurônios motores individuais2,4,5,6.

Durante o desenvolvimento inicial do sistema nervoso, neuroblasts dividir e gerar um grande número de glia e neurônios. A relação espaço-temporal entre a delaminação e o perfil de expressão gênica dos neuroblastos já foi investigada em detalhes7,8,9. No caso do sistema de neurôniomotor, a formação da junção neuromuscular embrionária (NMJ) tem sido extensivamente estudada usando o aCC (célula de canto anterior), RP2 (camarão cru 2) e neurônios motores RP52,10. Por exemplo, quando o neurônio motor RP5 forma uma junção sináptica nascente, a filopodia pré-sináptica e pós-sináptica está misturada11,12,13. Essa comunicação celular direta é vital para iniciar a formação nmj. Ao contrário do que sabemos sobre os ramos nervosos periféricos, nosso conhecimento de como os dendritos motores iniciam conectividade sináptica dentro do SNC ainda é primitivo.

Neste relatório, apresentamos uma técnica que permite a rotulagem retrógrada dos neurônios motores em embriões por meio de entrega mediada por micropipette de corantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear os 38 neurônios motores innervating cada um dos 30 músculos da parede do corpo em um hemi-segmento em 15 h após a postura de ovos (AEL)14. Ao utilizar esta técnica, o nosso grupo investigou exaustivamente numerosos alelos de ganho de função/perda de função15,16,17. Recentemente, desvendamos os mecanismos moleculares que impulsionam o início da conectividade de dendrita motoreae e demonstramos que uma interação Dscam1-Dock-Pak define o local de conseqüência dendrita no neurônio motoraCC 17. Em geral, esta técnica é adaptável para a análise fenotípica de quaisquer neurônios motores embrionários em tipo selvagem ou cepas mutantes, aumentando a nossa capacidade de fornecer novos insights sobre o design funcional do sistema nervoso Drosophila.

Protocol

1. Equipamentos e Suprimentos Materiais para a coleta de embriões e treinamento de adultos para pôr ovos Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mL e abrindo um buraco na tampa para definir um filtro de malha com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)entre o tubo e a tampa.NOTA: Alternativamente, filtros celulares com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)podem ser usados para a etapa de filtragem da coleta de embriões. Faça pratos de ágar c…

Representative Results

Uma imagem representativa dos neurônios motores aCC e RP3 é mostrada na Figura 3C para demonstrar a rotulagem multicolorida dos neurônios motores a 15 h AEL. Suas morfologias dendríticas são em grande parte invariáveis entre embriões. O padrão de coloração obtido com anticorpo anti-HRP é mostrado em cinza. Uma pequena gota de DiO ou DiD foi depositada no NMJ do músculo 1 ou 6/7, respectivamente. A Figura 4 demonstra a capacidade de m…

Discussion

O uso de rotulagem de corante para estudar morfologia neuronal tem várias vantagens sobre as técnicas genéticas de rotulagem de células. A técnica de rotulagem de corante pode minimizar a quantidade de tempo necessário para rotular e imaginar as morfologias dos neurônios motores. O processo de rotulagem de corante é bastante rápido, pois é preciso menos de 2 h e nos permite definir o contorno das projeções neuronais. Como alternativa, pode-se visualizar o neurônio motor aCC escolhendo uma linha GAL4 que expr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos membros do Laboratório Kamiyama por comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 NS107558 (para M.I., K.B., e D.K.).

Materials

10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22×22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

References

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Cite This Article
Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

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