Summary

Visualisierung des Makrophagen-Lytic Zelltodes während der mykobakteriellen Infektion bei Zebrafischembryonen mittels Intravital-Mikroskopie

Published: January 09, 2019
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Visualisierung des Makrophagenverhaltens und des Todes bei embryonalen Zebrafischen während einer Mycobacterium marinum-Infektion. Schritte zur Herstellung von Bakterien, Infektionder tenatierter Embryonen und intravitale Mikroskopie sind enthalten. Diese Technik kann auf die Beobachtung von Zellverhalten und Tod in ähnlichen Szenarien mit Infektion oder sterile Entzündung angewendet werden.

Abstract

Zebrafish ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunzellverhaltens aufgrund seiner transparenten Natur und der Abhängigkeit ausschließlich von seinem angeborenen Immunsystem während der frühen Entwicklung. Das Infektionsmodell des Zebrafischs Mycobacterium marinum (M. marinum) hat sich bei der Untersuchung der Immunantwort des Wirts gegen mykobakterielle Infektionen etabliert. Es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene Makrophagenzell-Todestypen zu den verschiedenen Ergebnissen einer mykobakteriellen Infektion führen werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Intravital-Mikroskopie, um den Tod von Makrophagenzellen in Zebrafisch-Embryonen nach einer M. marinum-Infektion zu beobachten. Zebrafisch transgene Linien, die speziell Makrophagen und Neutrophile kennzeichnen, werden durch intramuskuläre Mikroinjektion von fluoreszierend M. marinum entweder im Mittelhirn oder im Rumpf infiziert. Infizierte Zebrafisch-Embryonen werden anschließend auf niedrigschmelzender Agarose montiert und durch konfokale Mikroskopie in X-Y-Z-T-Dimensionen beobachtet. Da langzeitige Live-Bildgebung niedrige Laserleistung erfordert, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden, wird eine stark exsemitende transgene empfohlen. Dieses Protokoll erleichtert die Visualisierung der dynamischen Prozesse in vivo, einschließlich Immunzellmigration, Interaktion mit Wirtspathogenen und Zelltod.

Introduction

Eine mykobakterielle Infektion hat gezeigt, dass sie zum Tod von Immunzellenführt 1. Beispielsweise löst ein abgeschwächter Stamm Apoptose in Makrophagen aus und enthält die Infektion. Jedoch, ein virulenter Stamm wird lytische Zelltod auslösen, was bakterielle Verbreitung1,2. In Anbetracht der Auswirkungen dieser verschiedenen Arten von Zelltod auf die antimykobakterielle Reaktion des Wirts ist eine detaillierte Beobachtung des Todesfälles von Makrophagenzellen während einer mykobakteriellen Infektion in vivo erforderlich.

Die herkömmlichen Methoden zur Messung des Zelltodes sind die Verwendung von toten Zellflecken, wie Annnexin V, TUNEL oder Acridin orange/propidiumiodid Färbung3,4,5. Diese Methoden sind jedoch nicht in der Lage, Licht auf den dynamischen Prozess des Zelltodes in vivo zu werfen. Die Beobachtung des Zelltodes in vitro wurdebereits durch Live-Bildgebung 6 erleichtert. Ob die Ergebnisse jedoch die physiologischen Bedingungen genau imitieren, bleibt unklar.

Zebrafische waren ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung von Host Anti-Mycobacterium Antworten. Es hat ein hochkonserviertes Immunsystem ähnlich dem des Menschen, ein leicht zu manipulierendes Genom, und die frühen Embryonen sind transparent, was eineliveeBildgebung 7,8,9ermöglicht. Nach einer Infektion mit M. marinum bilden erwachsene Zebrafische typische reife Granulomstrukturen, und embryonale Zebrafische bilden frühe Somaulom-ähnliche Strukturen9,10. Der dynamische Prozess der angeborenen Immunzell-Bakterien-Interaktion wurde zuvor im Zebrafisch M. marinum Infektionsmodell11,12untersucht. Aufgrund der hohen räumlich-zeitlichen Auflösung bleiben die Details rund um den Tod der angeborenen Immunzellen jedoch weitgehend undefiniert.

Hier beschreiben wir, wie der Prozess des makrophagenlytischen Zelltodes visualisiert wird, der durch eine mykobakterielle Infektion in vivo ausgelöst wird. Dieses Protokoll kann auch auf die Visualisierung zellulärer Verhalten in vivo während der Entwicklung und Entzündung angewendet werden.

Protocol

Zebrafische wurden unter Standardbedingungen in Übereinstimmung mit Labortierrichtlinien zur ethischen Überprüfung des Tierschutzes (GB/T 35823-2018) aufgezogen. Alle Zebrafischexperimente in dieser Studie wurden genehmigt (2019-A016-01) und wurden am Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, durchgeführt. 1. M. marinum Einzelzell-Inokulum-Vorbereitung (Abbildung 1) Cerulean-fluoreszierenden M. Marinumglycerinbestand…

Representative Results

Mycobacterium-Infektion kann verschiedene Wirtsreaktionen basierend auf den Infektionswegen auslösen. In diesem Protokoll werden Zebrafischembryonen durch intramuskuläre Mikroinjektion fluoreszierender Bakterien in das Mittelhirn oder den Rumpf infiziert (Abbildung 3) und durch konfokale Live-Bildgebung beobachtet. Eine Infektion über diese beiden Routen wird die Infektion lokal einschränken, die angeborene Immunzellrekrutierung und den anschließenden Zelltod verursacht. <p class="j…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung des Makrophagensterbens während einer mykobakteriellen Infektion. Basierend auf Faktoren wie der Integrität der Zellmembran kann der infektionsgetriebene Zelltod in Apoptose und lytischen Zelltod24,25unterteilt werden. Lytischer Zelltod ist für den Organismus stressiger als Apoptose, weil er eine starke Entzündungsreaktion auslöst 24,25. Die Beobachtung …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Zilong Wen für die gemeinsame Nutzung von Zebrafischstämmen, Dr. Stefan Oehlers und Dr. David Tobin für die gemeinsame Nutzung der Ressourcen von M. marinum, Yuepeng He für die Unterstützung bei der Figurenvorbereitung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), dem Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) und Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018YQ54) (B.Y.) (B.Y.) unterstützt.

Materials

0.05% Tween-80 Sigma P1379
10 mL syringe Solarbio YA0552
10% OADC BD 211886
3-aminobenzoic acid Sigma E10521
5 μm filter Mille X SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin Sangon Biotech A600230
7H10 BD 262710
7H9 BD 262310
A glass bottom 35 mm dish In Vitro Scientific D35-10-0-N
Agarose Sangon Biotech A60015
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Enviromental Chamber Pecon temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader Eppendorf No.5242956003
Glass microscope slide Bioland Scientific LLC 7105P
Glycerol Sangon Biotech A100854
Incubator Keelrein PH-140(A)
M.marinum ATCC BAA-535
Microinjection needle World Precision Instruments IB100F-4
Microinjector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
msp12:cerulean Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red Sigma P3532
PTU Sigma P7629
Single concavity glass microscope slide Sail Brand 7103
Sonicator SCICNTZ JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600) Eppendorf AG 22331 Hamburg
Stereo Microscope OLYMPUS SZX10
Tg(mfap4:eGFP) Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Ref.: PMID 27424497; 17477879

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Cite This Article
Niu, L., Wang, C., Zhang, K., Kang, M., Liang, R., Zhang, X., Yan, B. Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e60698, doi:10.3791/60698 (2019).

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